艾麗梅 潘 靜 孫園園 （遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科,錦州 121001）

熱處理淋巴瘤細(xì)胞增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的抗瘤效應(yīng)研究

艾麗梅 潘 靜 孫園園 （遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科,錦州 121001）

目的:探討淋巴瘤細(xì)胞熱處理后作為抗原,沖擊樹突狀細(xì)胞而引發(fā)的抗淋巴瘤免疫效應(yīng)。方法:用健康人外周血分離出單核細(xì)胞,體外培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells,DCs）,將淋巴瘤細(xì)胞株熱處理（42℃,2小時(shí)）培養(yǎng)24小時(shí)后負(fù)載于DCs,在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)DCs的免疫表型變化;負(fù)載抗原后的DCs與淋巴細(xì)胞混合反應(yīng),以MTT法評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性及在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)淋巴細(xì)胞的免疫表型;ELISPOT法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)因子IFN-γ的釋放。結(jié)果:在兩實(shí)驗(yàn)組中,DCs負(fù)載了熱處理的淋巴瘤抗原后,細(xì)胞表面的共刺激分子和MHCⅡ類分子表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05）,而兩組之間差別無顯著性（P＞0.05）;經(jīng)熱處理的腫瘤細(xì)胞負(fù)載于DCs后,與淋巴細(xì)胞混合后IFN-γ的釋放量明顯增加;混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)后,細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT法）和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果均顯示兩實(shí)驗(yàn)組的殺瘤作用強(qiáng)于對(duì)照組（P＜0.05）,兩組之間無顯著差別（P＞0.05）。結(jié)論:用熱處理的淋巴瘤細(xì)胞作為腫瘤抗原沖擊DC,能夠增強(qiáng)抗淋巴瘤效應(yīng)。

熱處理;淋巴瘤;樹突狀細(xì)胞

淋巴瘤（Lymphoma）是一類異常復(fù)雜的疾病,近十年來患病率逐年增加,因此人們對(duì)其研究也不斷深入,從而推動(dòng)了治療方法上的改進(jìn)。免疫學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展促進(jìn)了腫瘤免疫治療的研究,特別是淋巴瘤的治療,更是突破了傳統(tǒng)的放療、化療手段,結(jié)合生物治療突顯其優(yōu)勢(shì),而生物治療包括了大部分的免疫治療,可見,淋巴瘤的免疫治療具有重要性和遠(yuǎn)大的應(yīng)用前景[1-3]。

抗腫瘤免疫應(yīng)答產(chǎn)生的重要條件是具備有效加工和通過合適MHC分子提呈的腫瘤特異抗原。樹突狀細(xì)胞（DC）是引起有效的T細(xì)胞免疫的最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞。隨著近年對(duì)大量擴(kuò)增人DC技術(shù)的成熟,使利用這些抗原負(fù)載后的DC作為治療性疫苗成為可能[4,5]。目前由于腫瘤抗原的限制性,多用整個(gè)細(xì)胞抗原負(fù)載DC使其經(jīng)過“自然”加工和選擇抗原表位,引發(fā)包含CD4+T細(xì)胞和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTL）克隆產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。熱處理腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)熱休克蛋白（HSP）表達(dá)增加,而近年來人們發(fā)現(xiàn)HSP具有參與抗原呈遞、誘導(dǎo) DC成熟等作用[6],本實(shí)驗(yàn)基于上述觀點(diǎn)而將淋巴瘤細(xì)胞熱處理后負(fù)載于DC,對(duì)其抗腫瘤的免疫效應(yīng)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 IMDM培養(yǎng)基（Iscove's Modified Dulbecco'smedium,IMDM）和胎牛血清均為美國Gibco公司產(chǎn)品;人淋巴細(xì)胞分離液為天津?yàn)笊锕井a(chǎn)品;細(xì)胞因子GM-CSF、rIL-4為廈門特寶生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;CD4、CD8、CD25、CD56、CD83、CD80、CD86 、HLA-DR等單克隆抗體和流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）均為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品;MTT（噻唑鹽）購自Sigma公司;ELISPOT試劑盒為瑞典Mabtech公司產(chǎn)品;人淋巴瘤細(xì)胞株（Daudi和Namalva）為北大醫(yī)院血液科細(xì)胞治療室饋贈(zèng)。

1.2 體外培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞 取健康志愿者外周血分離單核細(xì)胞。將50ml新鮮外周血緩慢加到淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll液）表面,與其比例為1∶3,離心（2 000 r/min,20分鐘）,吸取中間白膜層到另一離心管中,用PBS液洗一遍（1 250 r/min,10分鐘）后,用IMDM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,按每瓶細(xì)胞數(shù)為1×107個(gè)接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中。于37℃、5%CO2孵育箱中放置2小時(shí),使細(xì)胞貼壁。將懸浮細(xì)胞用尼龍毛柱法[7,8]分離出T淋巴細(xì)胞,放置液氮中凍存,留作效應(yīng)細(xì)胞。已接種了細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入細(xì)胞因子GM-CSF（終濃度1 000U/m l）、IL-4（終濃度500U/m l）。每3天更換一次相同的培養(yǎng)體系。

1.3 熱處理腫瘤細(xì)胞 分別取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Daudi和Namalva細(xì)胞株（1×106個(gè)）進(jìn)行熱處理,即在恒溫42℃下培養(yǎng)2小時(shí)后,離心（800 r/min,5分鐘）、用PBS重懸細(xì)胞、再離心（800 r/min,5分鐘）、加入IMDM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,在37℃、5%CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 抗原負(fù)載 將熱處理的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后取出,按照不同的實(shí)驗(yàn)組與DC混合,即:熱處理的Daudi細(xì)胞負(fù)載DC組（H1）,熱處理的Namalva細(xì)胞負(fù)載DC組（H2）,無熱處理的Daudi細(xì)胞負(fù)載DC組（Control 1）,無熱處理的Namalva細(xì)胞負(fù)載DC組（Control 2）。腫瘤細(xì)胞與DC混合比例為1∶10。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 抗原負(fù)載DC 48小時(shí)后,在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)DC分化抗原CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表達(dá);負(fù)載抗原后的DC與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)4天后,收集懸浮細(xì)胞液,檢測(cè)各組CD4、CD8、CD25、CD56的表達(dá)水平。

1.6 ELISPOT檢測(cè)胞內(nèi)IFN-γ釋放 先將淋巴細(xì)胞懸液加到ELISPOT 96孔板中（細(xì)胞數(shù)2.5×105個(gè)/well）,再按不同效靶比例加入各組經(jīng)抗原刺激的DC細(xì)胞,在37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)24小時(shí)后,按照試劑盒操作步驟說明,進(jìn)行洗板、加入生物素標(biāo)記

抗體、再洗板、加酶標(biāo)親和素、顯色,最后在讀板機(jī)上掃描和計(jì)數(shù)IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞。

1.7 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT法） DC細(xì)胞與淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)4天后收集細(xì)胞懸液,按不同濃度等級(jí)（每濃度復(fù)3孔）加到96孔板中（按效靶比為10∶1、20∶1、50∶1）,靶細(xì)胞為Daudi和Namalva細(xì)胞。在37℃、5%CO2箱中孵育 48小時(shí),每孔加MTT液10μl（5 g/L）,繼續(xù)孵育4小時(shí)。離心棄上清,每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100μl終止反應(yīng),震蕩溶解顆粒,用酶標(biāo)檢測(cè)儀于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度（A值）,并計(jì)算殺傷率。計(jì)算公式為:殺傷率=[1-（效靶實(shí)驗(yàn)組A值-效細(xì)胞對(duì)照A）/靶細(xì)胞對(duì)照組A值]×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,數(shù)據(jù)以均數(shù)±s表示,組間比較采用方差分析,P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樹突狀細(xì)胞的免疫表型 如圖1所示,H1組和H2組的CD80、CD86、HLA-DR均較對(duì)照組明顯增加,而兩組之間無明顯差別。結(jié)果表明,熱處理24小時(shí)的Daudi和Namalva細(xì)胞沖擊DC后,均使其表面共刺激因子和MHCⅡ類分子表達(dá)增加,加速抗原呈遞和促DC的成熟。

2.2 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的釋放 腫瘤細(xì)胞經(jīng)或未經(jīng)熱處理后負(fù)載到DC上,再與自身淋巴細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)后檢測(cè)IFN-γ的釋放。結(jié)果表明（圖2）,IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞的數(shù)量隨著效靶比例增大而增加,并且實(shí)驗(yàn)組均大于對(duì)照組（P＜0.05）。尤以效靶比是1∶10時(shí),與對(duì)照組之間比較差別顯著（P＜0.05）。

2.3 淋巴細(xì)胞的免疫表型 表1結(jié)果顯示,H 1組和H2組的CD8+、CD25+和CD56+細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05）,而兩組之間無明顯差別;結(jié)果也表明,實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTLs）的生成增加。

2.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分析 如圖3所示,各組的殺傷活性均隨效靶比（E∶T）增大而增加;H1和H2組的殺傷毒性明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）,而兩組之間無明顯差別。

表1 淋巴細(xì)胞免疫表型分析（%,n=3,±s）Tab.1 Lym phocy tic immunophenotyping（%,n=3,±s）

表1 淋巴細(xì)胞免疫表型分析（%,n=3,±s）Tab.1 Lym phocy tic immunophenotyping（%,n=3,±s）

Note:1）Compared with Control 1 and Control 2 group respectively,P＜0.05.

CD4+ CD8+ CD25+ CD56+H 1 33.65±1.04 41.46±1.081） 5.24±0.091） 7.78±0.291）H 2 35.99±0.42 41.52±0.721） 5.13±0.101） 7.71±0.351）Control l 163.88±0.51 22.56±0.65 1.55±0.04 1.24±0.07 Control2 265.84±0.57 23.26±0.88 1.35±0.06 1.29±0.05

圖1 樹突狀細(xì)胞（DC）免疫表型Fig.1 Immunophenotype for dend ritic cells

圖2 ELISPOT法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ的釋放Fig.2 Detection of IFN-γsecretion by ELISPOT

圖3 細(xì)胞毒性分析Fig.3 Cytotoxicity analysis

3 討論

本研究將熱處理的淋巴瘤細(xì)胞作為腫瘤抗原沖擊樹突狀細(xì)胞（DC）,通過細(xì)胞免疫引發(fā)了抗淋巴瘤效應(yīng);同時(shí)比較對(duì)照組的結(jié)果,說明確實(shí)發(fā)生了增強(qiáng)的抗瘤作用。

DC隨著捕獲抗原而成熟,同時(shí)抗原被加工成小肽（抗原肽）遞呈給初始T細(xì)胞和引發(fā)細(xì)胞免疫,包括CD4+T（Th1）和細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞。因此,明確促發(fā)理想DC成熟的刺激很重要,它會(huì)誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL生成。近年來的研究表明,熱休克蛋白（HSP）具有重要的免疫學(xué)意義,包括可以結(jié)合于腫瘤抗原肽,協(xié)助其提呈。而熱處理可誘發(fā)HSP高表達(dá)[9,10]。

熱休克蛋白是一種執(zhí)行管家功能和細(xì)胞保護(hù)功能的細(xì)胞內(nèi)蛋白,近20年來,越來越多的證據(jù)顯示,它還具有重要的免疫學(xué)意義。其中,熱休克蛋白的抗腫瘤效應(yīng)頗值得關(guān)注。人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種熱休克蛋白可以參與這種抗腫瘤免疫[11]。HSP對(duì)免疫系統(tǒng)的作用不僅是一種分子伴侶,還是一種強(qiáng)有力的佐劑。如Blachere等[12]的實(shí)驗(yàn)表明,熱處理后形成的抗原肽可以被MHCⅠ類分子提呈,激活針對(duì)該腫瘤的CD8+T細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,經(jīng)熱處理后腫瘤細(xì)胞抗原能增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的抗原表達(dá),可以提高抗原提呈能力,最終使抗瘤效應(yīng)增強(qiáng),如我們觀察到細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞在熱處理組產(chǎn)生增多,即標(biāo)志CTL的CD8+、CD25+和 CD56+細(xì)胞率明顯增加,由此推斷,熱休克蛋白在樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫效應(yīng)機(jī)制中能發(fā)揮重要作用。我們通過試驗(yàn)組和對(duì)照組的比較發(fā)現(xiàn),由于腫瘤細(xì)胞經(jīng)過熱處理,可能會(huì)裂解形成較多的抗原片段來刺激樹突狀細(xì)胞,產(chǎn)生的CTL細(xì)胞明顯增加,而未經(jīng)熱處理的腫瘤抗原的作用則不充分。

熱處理后的腫瘤細(xì)胞作為抗原沖擊樹突狀細(xì)胞,促進(jìn)其抗原提呈能力并增強(qiáng)抗瘤效應(yīng),其中涉及的機(jī)制不僅是細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞數(shù)量增加,同時(shí)也伴隨細(xì)胞因子（干擾素-γ）的釋放量增加,協(xié)同阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖,增強(qiáng)了抗瘤效應(yīng)。綜上所述,我們由本研究可以得出結(jié)論,體外熱處理淋巴瘤細(xì)胞株作為腫瘤抗原能增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞抗淋巴瘤的免疫效應(yīng)。

1 Borchmann P,Schnell R,Engert A.Immunotherapy of Hodgkin′s lymphoma[J].Eur JHaematol,2005;75（Suppl 66）:159-165.

2 Hainsworth JD,Litchy S,Burris H A 3rdetal.Rituximab as first-line and maintenance therapy for patients with indolent non-Hodgkin′s lymphoma[J].JClin Oncol,2002;20（20）:4261-4267.

3 Schnell R,Borchmann P,Staak JOetal.Clinical evaluation of ricin A-chain immunotoxins in patients with Hodgkin′s lymphoma[J].Ann Oncol,2003;14（5）:729-736.

4 ZeisM,Siegel S,Wagner Aetal.Generation of cytotoxic responses in mice and human individualsagainsthematologicalmalignanciesusing survivin-RNA-transfected dendritic cells[J].J Immunol,2003;170（11）:5391-5397.

5 Bchler T,Michalek J,Kovarova Letal.Dendritic cell-based immunotherapy for the treatment of hematological malignancies[J].Hematology,2003;8（2）:97-104.

6 UdonoH,SrivastaraPK.Heatshock protein 70-associated peptideselicits specific cancer immunity[J].JExpMed,1993;178（4）:1391-1396.

7 周正任,葉曉卉,楊曉臨.小鼠小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的提取與抗原表型測(cè)定和功能的初步研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2001;17（3）:135-137.

8 祁贊梅,呂昌龍,劉北星etal.腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞促L929細(xì)胞增殖活性的研究[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005;34（4）:292-293.

9 HayashiY,Tohnai J,KobayashiTetal.Trans-location ofhsp-70 and protein synthesis during countinousheating atm ild temperatures in Hela cells[J].Radio Res,1991;125:80-88.

10 王 莉.腫瘤熱療與免疫治療[J].國際腫瘤學(xué)雜志,2006;5（33）:357-359.

11 Wang X Y,Kazim L,Repasky E Aetal.Characterization of heat shock protein 110 and glucose-regulated protein 170 as cancer vaccinesand the effectof fever-range hypertherm ia on vaccine activity[J].J Immunol,2001;166（1）:490-497.

12 Blachere N E,LiZ,Chandawarkar RYetal.Heat shock protein-peptide complexes,reconstituted in vitro,elicit peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity[J].JExp Med,1997;186（8）:1315-1322.

[收稿2009-07-05 修回2009-12-21]

（編輯 倪 鵬）

Enhancement of antitumor immunity of dendritic cells pulsed w ith hypertherm ia lymphoma cells

AILi-Mei,PANJing,SUNYuan-Yuan.DepartmentofHematology,LiaoningMedicalUniversityFirstHospital,Jinzhou121001,China

Objective:To investigate the immuno-effects triggered by dendritic cells（DCs）pulsed with Heat-treated lymphoma cells.Methods:Mononuclear cells from healthy human peripheralblood（PBMC）were isolated and DCswere generated in vitrowith normalmethods.Lymphoma cellswere heated（42℃,2 h）and then loaded onto DCs.Immunotypes of DCs and lymphocyteswere detected with flow-cytometric analysis.IFN-γreleasing was detected by ELISPOT,lymphocyte cytotoxicity was analyzed by MTTmethod aftermixing with DC reaction.Results:After pulsing DCswith hyperthermia lymphoma cells,CD80+,CD86+and HLA-DR existed higher than those of the control group,IFN-γ releasing and cytotoxicitieswere also strengthened,but there was no difference between them,cytotoxitic lymphocytes（CTLs）were produced more as CD8+,CD25+and CD56+cells by flow-cytometric analysis.Conclusion:Anti-lymphoma immuno-effects could be strengthened by loading DCwith hypertherm ia lymphoma cells.

Hyperthermia;Lymphoma;Dendritic cell

R730.51

A

1000-484X（2010）03-0232-04

艾麗梅（1968年-）,女,醫(yī)學(xué)博士,副教授,主任醫(yī)師,主要從事血液腫瘤免疫治療方面的研究。

·神經(jīng)內(nèi)分泌與免疫·