崔天盆 胡必成 (武漢市第一醫(yī)院臨床免疫學實驗室,武漢 430022)
Ghrelin活化人T細胞翻譯起始分子通過m TOR信號轉導通路①
崔天盆 胡必成 (武漢市第一醫(yī)院臨床免疫學實驗室,武漢 430022)
目的:探討Ghrelin活化人T細胞翻譯起始分子的信號轉導機理。方法:采用微柱法分離人外周血T細胞,采用Western blot方法檢測mTOR信號通路分子和蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控分子的磷酸化狀態(tài)和含量。采用mTOR抑制劑:雷帕霉素,PI3KⅠ抑制劑:LY294002,PI3KⅢ抑制劑:3-甲基腺嘌呤,Ghrelin拮抗劑:Des-Lys-3-GHRP6和AKT抑制劑:A443654和Ghrelin研究相應信號通路。結果:①人T細胞表面有Ghrelin受體(GHSR1a)表達。②Ghrelin與GHSR1a結合后可活化mTOR。③Ghrelin磷酸化兩個mTOR下游靶分子4E-BP-1和P70S6K,P70S6K進一步磷酸化核糖體S6蛋白。④Ghrelin磷酸化蛋白質(zhì)翻譯起始帽子結構的兩個重要分子eIF4E和eIF4G。結論:Ghrelin促進人T細胞mRNA翻譯起始的機理是活化mTOR信號轉導通路。
Ghrelin;哺乳類雷帕霉素靶蛋白;T細胞;蛋白質(zhì)翻譯
Ghrelin是由胃X/A樣內(nèi)分泌細胞分泌的胃腸肽激素,饑餓時血中濃度最高,進食1小時后最低。GHRP-6是最早發(fā)現(xiàn)的不與生長激素釋放激素受體結合的促進生長激素分泌的多肽,隨后發(fā)現(xiàn)一系列肽類和非肽類促生長激素分泌的化合物,稱之為生長激素促分泌素(growth hormone secretagogues,GHSs),1995年Howard[1]從垂體和下丘腦克隆到可與GHS結合的孤兒受體——生長激素促分泌素受體1a(GH secretagogue receptor 1a,GHSR1a)。然而直到1999年Kojima[2]才從胃中克隆純化GHSR1a內(nèi)源性配體——Ghrelin。Ghrelin是含 28個氨基酸的多肽,Ghrelin氨基端第三位絲氨酸被辛烷化,且目前認為辛烷化Ghrelin可與GHSR結合,是Ghrelin的活化形式。Ghrelin能促進進食和體重的增加,其促進進食的效應強于目前已知的神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY),而且長期應用Ghrelin能增加體重。此外Ghrelin/GHSR1a還有其他中樞和外周功能,如激素分泌、血糖穩(wěn)定、胰腺功能、生殖、胃腸蠕動、心血管功能、細胞分化和生存、免疫和炎癥、骨代謝、記憶和睡眠等。Ghrelin的系列功能是通過Ghrelin與GHSR1a結合從而啟動胞內(nèi)信號轉導來實現(xiàn)的。
不同作者對Ghrelin與GHSR1a結合后啟動的信號轉導機理進行研究[3,4]。發(fā)現(xiàn)一些信號分子參與Ghrelin的信號轉導。使用HEK293和CHO細胞表達GHSR1a,通過同位素結合分析、激光共聚焦顯微鏡分析,受體活化后胞內(nèi)Ca2+濃度升高。Ghrelin作用于豬生長激素細胞通過AC/PKA、PLC/PKC和胞內(nèi)鈣通路轉導信號。除了Ghrelin介導的離子電流效應,Ghrelin通過MAPK介導細胞分化功能,采用CHO細胞穩(wěn)定表達GHSR1a模型,研究發(fā)現(xiàn)Ghrelin通過PLC、PKCε活化 ERK1/2通路。然而在3T3-L1前脂肪細胞,Ghrelin通過PI-3K/AKT和百日咳毒素敏感G蛋白(Gi/o)活化MAPK。在胰腺癌細胞也發(fā)現(xiàn)通過PI3-K/AKT通路。在人和大鼠腎上腺小球細胞(adrenal zona glomerulosa cells),Ghrelin促進細胞分化通過ERK1/2,而不依賴PKA和PKC。在肝細胞,Ghrelin磷酸化IRS-1和結頭蛋白-生長因子受體結合蛋白2及MAPK,因此在這種細胞GHSR的信號轉導與胰島素的信號分子交叉,Ghrelin和胰島素聯(lián)合應用可增加IRS-1的磷酸化。
人T細胞和單核細胞表達Ghrelin和Ghrelin受體,Ghrelin通過Ghrelin受體特異性抑制前炎性細胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的表達。Ghrelin以劑量依賴方式抑制瘦素誘導的前炎性細胞因子表達。用Ghrelin治療LPS誘導鼠內(nèi)毒素模型,發(fā)現(xiàn)Ghrelin有抗炎效應。應用Ghrelin或GHSR激活有助于改善疾病相關的惡液質(zhì)。
隨著年齡增長,胸腺表達Ghrelin和Ghrelin受體減低,用Ghrelin治療14月齡小鼠可顯著改善胸腺結構和增加胸腺細胞數(shù)量,增加胸腺流出和改善外周T細胞TCR多樣性[5,6]。
本文旨在研究Ghrelin作用T細胞的信號轉導機理,由于Ghrelin的基本功能是調(diào)節(jié)機體進食、代謝和能量平衡,因此我們選擇哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號轉導通路作為研究對象。
1.1 研究對象 健康獻血者,年齡35~55歲,不吸煙,無過敏史。采集外周血200m l。
1.2 試劑 高純度人Ghrelin(純度=98.7%)購自EZbiolab公司(EZbiolab Inc.Westfield,IN 46074,USA);(D-Lys3)-GHRP-6(純度>95%,Phoenix Pharmaceuticals Inc.Burlingame,CA 94010,USA)。PI3K 抑制劑—LY294002(Calbiochem,La Jolla,CA),雷帕霉素(rapamycin,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)。3-甲基腺嘌呤(Sigma:M 9281);Akt inhibitor(2S)-1-(1HIndol-3-yl)-3-[5-(3-methyl-2H-indazol-5-yl)pyridin-3-yl]oxypropan2-amine(A443654,Invitrogen),RIPA緩沖液(Sigma R0278,Saint Louis,M issouri 63103),蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor cocktail,Sigama P8340),磷酸酶抑制劑(Phosphatase inhibitor cocktail1,Sigma P8340和Phosphatase inhibitor cocktail2,Sigma P5726)。
1.2 研究方法
1.2.1 人T細胞分離 首先用Ficoll分離液分離人外周血單個核細胞(包括淋巴細胞和單核細胞),用R&D公司(R&D Systems,Minneapolis,Minnesota,USA)的T細胞富集柱(Cat#:HTCC-25)用高親和陰性選擇法分離T細胞,具體參照R&D公司的使用說明書,T細胞純度為95%。簡言之,外周血單個核細胞通過抗免疫球蛋白包被的T細胞富集柱,B細胞通過BCR與抗體結合,而單核細胞通過Fc受體結合后留在富集柱上,用相應緩沖液洗滌三次,得到純度大于95%的T細胞。
1.2.2 免疫印跡(Western blot) 人外周血T細胞加入含青霉素、鏈霉素的RPMI,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中,血清饑餓過夜。使用Ghrelin或適當抑制劑,每10×106人外周血T細胞加入0.1 ml含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液,T細胞RIPA裂解液置冰上15分鐘,4℃14 000 r/min離心15分鐘,上清轉入另一近潔凈EP管,采用BCATM(PIERCE,23227,Rockford,IL,USA)蛋白定量分析檢測蛋白含量。2~20μg蛋白采用Invitrogen公司的4%~12%梯度Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,電轉移到0.22μm PVDF膜。已轉印的PVDF膜置5%脫脂奶粉-TBST室溫中振蕩封閉 1小時。已轉印的PVDF膜置于適當稀釋的第一抗體中4℃旋轉過夜;然后在室溫下用1×TBST洗膜三次,每次10分鐘;將膜置于適當稀釋的含辣根過氧化物酶標記的二抗(horseradish peroxidase-labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L),Southern Biotech.Birmingham,Alabama 35209;或donkey anti-mouse IgG-HRP,Santa Cruz Biotech,sc-2096)的1×TBST中,室溫振蕩 1小時;室溫條件下用1×TBST洗膜三次,每次10分鐘。最后采用ECLplus化學發(fā)光底物(ECLplus,Amersham Place,Little Chalfont,Buckinghamshire,UK),具體根據(jù)使用說明書操作。用PIERCE公司X線膠片曝光記錄結果,使用Alpha Innotech Imaging system公司掃描。所用抗體如下:GHS-R1 antibody(D-16)(Santa Cruz Biotechnology Inc.sc-10362,Santa Cruz,CA95060).PhosphomTOR(Ser2448)antibody(Cell Signaling,#2971,Danvers,MA01923),mTOR antibody(Cell Signaling,#2972);Phospho-p70 S6 kinase(Thr389)rabbitmonoclonal antibody(Cell Signaling#9234),Anti-p70 S6 kinase antibody(Upstate,#06-926);Anti-phospho-ribosomal protein S6(Ser235)antibody(Upstate,#05-795),S6 ribosomal protein(54D2)mousemAB(Cell signaling,#2317),Phospho-4E-BP1(Ser65)antibody(Cell Signaling,#9451),4E-BP1 antibody(Cell Signaling,#9452);Phospho-eIF4E(Ser209)antibody(Cell Signaling,#9741),eIF4E antibody(Santa Cruz,sc-9976););Phospho-eIF4G(Ser1108)antibody(Cell Signaling,#2441),eIF4G antibody(SantaCruz,sc-11373)。
2.1 人T細胞表達GHSR1a T細胞富集柱分離的T細胞,采用免疫印跡法檢測,人T細胞表達GHSR1a。具體見圖1。
2.2 Ghrelin與GHSR1a結合誘導mTOR磷酸化 哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,在細胞信號轉導中有重要作用,mTOR可調(diào)控正常細胞或癌細胞蛋白質(zhì)合成、細胞分化和細胞體積增大。
100 ng/mlGhrelin誘導mTOR 2448位絲氨酸磷酸化和活化,10分鐘開始活化,30分鐘達高峰,進一步活化下游P70 S6激酶389位蘇氨酸磷酸化和活化;活化的P70 S6激酶進一步活化更下游的核糖體S6蛋白的235位絲氨酸的磷酸化和活化,見圖2。雷帕霉素則抑制Ghrelin誘導的磷酸化和活化,見圖3,表明Ghrelin誘導的信號轉導依賴mTOR的活化。
2.3 Ghrelin誘導mTOR磷酸化通過GHSR1a、PI3K和AKT 人 T細胞與 1μmol/L Des-Lys-3-GHRP6(ghrelin拮抗劑),50μmol/L LY294002(PI3KⅠ抑制劑),4 mmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,PI3KⅢ抑制劑),1μmol/LA443654(AKT抑制劑),20 ng/m l雷帕霉素(mTOR抑制劑)37℃孵育1小時;采用Ghrelin分別治療未處理和抑制劑處理人T細胞,37℃15分鐘。采用免疫印跡檢測mTOR 2448位絲氨酸磷酸化強度,見圖3。Ghrelin誘導mTOR 2448位絲氨酸磷酸化和P70S6激酶389位蘇氨酸磷酸化可被Des-Lys-3-GHRP6、LY294002、3-甲基腺嘌呤和雷帕霉素所抑制。
2.4 Ghrelin誘導mRNA翻譯起始調(diào)控分子4E-BP-1、eIF4E和eIF4G磷酸化 Ghrelin誘導mTOR 2448位絲氨酸磷酸化和活化,進一步磷酸化下游mRNA翻譯抑制因子—真核翻譯起始因子4結合蛋白-1(4E-BP-1),15分鐘開始活化,30分鐘達高峰,4E-BP-1的65位絲氨酸磷酸化后,4E-BP-1與eIF4E的結合解除,4E-BP-1對eIF4E的抑制也解除,eIF4E與eIF4G和eIF4A組成復合物稱之為eIF4F,eIF4F與mRNA帽子結構結合啟動翻譯。
圖1 人T細胞表達Ghrelin受體Fig.1 Human T cells express GHSR1a
Ghrelin快速誘導eIF4E 209位絲氨酸磷酸化,5分鐘即達高峰,而eIF4G 1108位絲氨酸磷酸化15分鐘則達到高峰。eIF4E 209位絲氨酸磷酸化和eIF4G 1108位絲氨酸磷酸化也有助于蛋白質(zhì)翻譯起始,見圖4。
圖2 Ghrelin誘導人T細胞m TOR、p70 S6K和核糖體S6蛋白的磷酸化Fig.2 Ghrelin induces phosphorylation of m TOR,p70 S6K and S6 ribosomal p rotein in human p rimary T cells
圖3 Ghrelin誘導人T細胞m TOR,P70 S6K和核糖體S6蛋白的磷酸化依賴GHSR1a,PI3K,AKTFig.3 Ghrelin-mediatedm TOR P70S6 phosphorylation isGHSR1a,PI3K,AKT dependent
圖4 Ghrelin誘導人 T細胞4E-BP-1、eIF4E和 eIF4G的磷酸化Fig.4 Ghrelin induces phosphorylation of 4E-BP1,eIF4E and eIF4G
Ghrelin是28個氨基酸組成的多肽,其第3位絲氨酸在Ghrelin?;福℅OAT)作用下辛烷化,且3位絲氨酸的辛烷化對其發(fā)揮生物活性來說是必需的[7]。到目前為止,Ghrelin被中鏈脂肪酸修飾在激素中是唯一的。血清中也存在去?;疓hrelin(Desacyl-Ghrelin),其含量遠高于Ghrelin。正常人血清Ghrelin濃度是10~20 pmol/L,而總Ghrelin(包括Ghrelin和去?;疓hrelin)的濃度是100~150 pmol/L,短期饑餓情況下血漿Ghrelin濃度升高,進食后血漿Ghrelin濃度降低。McCowen和Shiiya等研究表明口服或靜脈注射葡萄糖可降低血漿Ghrelin濃度;喝水則不改變血漿Ghrelin濃度。肥胖者Ghrelin濃度低而消瘦者高。腫瘤、心衰或慢性消耗性疾病所致惡病質(zhì)Ghrelin濃度升高。
免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用,生長激素和饑餓激素Ghrelin表達于不同的免疫細胞,如T細胞、B細胞、單核細胞和中性粒細胞;免疫細胞也有生長激素受體和Ghrelin受體[8,9]。像Ghrelin作用于垂體細胞一樣,Ghrelin作用于免疫細胞表達生長激素。然而調(diào)節(jié)免疫細胞表達生長激素分泌與其他作用于垂體不同,細胞因子和絲裂原促進免疫細胞分泌生長激素,Ghrelin的生物活性包括減輕內(nèi)毒素休克和抗炎作用,調(diào)節(jié)吞噬和增加胸腺生成。
mTOR是保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,在細胞信號轉導中有重要作用,mTOR可調(diào)控細胞蛋白質(zhì)合成、細胞分化和細胞體積的增大[10]。mTOR對T細胞蛋白質(zhì)合成也有重要作用[11]。
本文研究發(fā)現(xiàn)人T細胞表達Ghrelin受體,Ghrelin通過GHSR1a活化T細胞mTOR通路。Ghrelin誘導mTOR和P70 S6磷酸化可被Des-Lys-3-GHRP6、雷帕霉素、LY294002、3-甲基腺嘌呤和A443654所抑制,表明Ghrelin活化T細胞mTOR通路是通過GHSR1a、mTOR、PI3K I和 Ⅲ以及AKT。
Ghrelin誘導mTOR 2448位絲氨酸磷酸化和活化,進一步磷酸化下游mRNA翻譯抑制因子—真核翻譯起始因子4結合蛋白-1的65位絲氨酸磷酸化后,4E-BP-1與eIF4E的結合解除,4E-BP-1對eIF4E的抑制也解除,eIF4E與eIF4G和eIF4A組成復合物稱之為eIF4F,eIF4F與mRNA帽子結構結合啟動翻譯。eIF4E 209位絲氨酸磷酸化和eIF4G 1108位絲氨酸磷酸化也有助于翻譯起始。因此Ghrelin活化T細胞mTOR通路有助于蛋白質(zhì)翻譯起始。
總之,Ghrelin促進人T細胞mRNA翻譯起始的機理是活化mTOR信號轉導通路,這也是第一個報道Ghrelin可在細胞水平活化mTOR信號轉導通路,將細胞代謝與免疫聯(lián)系起來。
1 Howard A D,Feighner SD,Cully D Fetal.A receptor in pituitary and hypothalamus that functions in growth hormone release[J].Science,1996;273(5277):974-977.
2 KojimaM,Hosoda H,Nakazato Metal.Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach[J].Nature,1999;402(6762):656-660.
3 Mousseaux D,LeGallic L,Ryan Jetal.RegulationofERK1/2 activity by ghrelin-activated growth hormone secretagogue receptor 1A involves a PLC/PKCepsilon pathway[J].Br JPharmacol,2006;148(3):350-365.
4 Camina JP,LodeiroM,Ischenko Oetal.Stimulation by ghrelin of p42/p44mitogen-activated protein kinase through the GHS-R1a receptor:role ofG-proteins and beta-arrestins[J].JCell Physiol,2007;213(1):187-200.
5 Dixit V D,Schaffer EM,Pyle RSetal.Ghrelin inhibits leptin-and activation-induced proinflammatory cytokine expression by human monocytes and T cells[J].JClin Invest,2004;114:57-66.
6 DixitV D,YangH,Sun Yetal.Ghrelin promotes thymopoiesis duringaging[J].JClin Invest,2007;117(10):2778-2790.
7 Yang J,Brown M S,Liang Getal.Identification of the acyltransferase that octanoylates ghrelin,an appetite-stimulating peptide hormone[J].Cell,2008;132(3):387-396.
8 HattoriN.Expression,regulation and biological actionsof growth hormone(GH)and ghrelin in the immune system[J].Growth Horm IGF Res,2009;19(3):187-197.
9 HattoriN,Saito T,Yagyu Tetal.GH,GH receptor,GH secretagogue receptor,and ghrelin expression in human T cells,B cells,and neutrophils[J].JClin EndocrinolMetab,2001;86(9):4284-4291.
10 Tobias Schmelzle,Michael N Hall.TOR,a central controller of cell growth[J].Cell,2000;103(2):253-262.
11 Beretta L.Translational control in T lymphocytes[J].Int Rev Immunol,2004;23(3-4):347-363.
[收稿2009-09-03 修回2009-11-29]
(編輯 許四平)
Ghrelin activates translation initiate factor in human T cells through m TOR pathway
CUITian-Pen,HUBi-Cheng.LaboratoryofClinicalImmunology,WuhanNo.1Hospital,Wuhan430022,China
Objective:Ghrelin is a brain-gut peptide with GH-releasing,apetide-inducing and anti-inflammation activities and with widespread tissue distribution.Ghrelin is the endogenous ligand of GH secretagogue receptor(GHSR),and both ghrelin and theGHSR are expressed in T cells.We therefore examined the effectofGhrelin on human T celland its signal transduction.Methods:Ghrelin-activatingmTOR pathway in human primary T cellwas studied using immunoblotting and inhibitors of the PI3K(LY294002,3-Methyladenine)ormTOR(rapamycin)and antagonistof GHSR1a(Des-Lys-3-GHRP6).Results:The results showed thatGHSR1a was expressed on T cells.Ghrelin caused a significant increase in the phosphorylatedmTOR,P70S6K,S6K,4E-BP-1,eIF4G,eIF4Eby immunoblotting.While the phosphorylatedmTOR,P70S6K were abolished by themTOR inhibitor rapamycin and PI3K inhibitor LY294002,3-methyladenine and alsoantagonistof GHSR1a,Des-Lys-3-GHRP6.Conclusion:The data document thatGhrelin activates translation of T cells throughmTOR pathway.
Ghrelin;mTOR;T cell;Translation
R392
A
1000-484X(2010)03-0205-05
①本課題為武漢市人事局留學回國人員創(chuàng)新專項資助
崔天盆(1967年-),男,博士,副主任技師,主要從事臨床免疫學研究,E-mail:Tianpencui@hotmail.com。