許海龍 劉俊生

膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,近年來(lái)發(fā)病率及病死率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)。吉西他濱對(duì)膀胱腫瘤具有不錯(cuò)的療效，常見(jiàn)的是吉西他濱聯(lián)合順鉑方案，但該方案對(duì)腎臟的損害作用限制了其在高齡及有腎功能和潛在腎功能損傷患者中的應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者報(bào)道，維生素C、維生素K3對(duì)某些腫瘤細(xì)胞系的增殖具有抑制作用，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察吉西他濱聯(lián)合維生素C和維生素K3對(duì)體外培養(yǎng)的膀胱腫瘤細(xì)胞抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 吉西他濱（LILLY FRANCE S.A公司，注冊(cè)證號(hào)H 20050171），維生素C、維生素K3（Sigma公司，USA），RPM 1640培養(yǎng)基，小牛血清（四季青公司）。四氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO），胰蛋白酶，碘化丙啶（PI），均為Sigma公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀（B-D公司，USA，F(xiàn)ACScalibur型）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱癌T24細(xì)胞株（山西醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供）。培養(yǎng)液為含10％小牛血清和100U/m l青霉素、100U/m l鏈霉素的RPM I1640，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，0.25％的胰酶和0.02％EDTA（1：1）消化傳代，每隔2～3天傳代一次，處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 藥物處理及分組 分4組：吉西他濱組；VC＋K3組；吉西他濱＋VC＋VK3組；空白對(duì)照組。MTT法篩選出前兩組藥物作用的最佳濃度?？瞻讓?duì)照組加入等體積培養(yǎng)液。

1.2.3 MTT檢測(cè)

（1）吉西他濱濃度的篩選 取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25％胰酶消化，細(xì)胞密度為5×104/孔接種于96孔板，貼壁24h后，分別加入不同濃度的吉西他濱（0.01、0.1、1、10ug/m l）,每濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液。藥物作用時(shí)間為72h。在試驗(yàn)結(jié)束前4h,取出培養(yǎng)板，加入MTT（5g/L）20UL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄上清，加入100u lDMSO,于微量板式振蕩器振蕩10m in,用酶標(biāo)儀在590nm波長(zhǎng)處讀取吸光度（A）值。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照組A 490值-實(shí)驗(yàn)組A 490值）/對(duì)照組A 490值×100％。

（2）吉西他濱聯(lián)合VC＋VK3濃度的篩選 選用吉西他濱作用72h后的最佳濃度，聯(lián)合一定比例（VC：VK3＝100：1）[1]不同濃度的VC＋VK3（100：1、250：2.5、500：5、1000：10umol/L），篩選出VC+VK3的最佳濃度。準(zhǔn)備方法和藥物處理同上。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 收集各組藥物作用72h后的T 24細(xì)胞（1.0ug/m l吉西他濱；1000：10um ol/LVC+VK3；1.0ug/m l吉西他濱＋1000：10umol/LVC+K3；空白對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液），使用磷酸緩沖液（PBS）清洗3次，加入冰預(yù)冷的70％乙醇4℃下固定12h以上。上機(jī)前離心棄去乙醇固定液，PBS清洗，37℃下與含10g/L RNA酶的Tris-HC l緩沖液（pH 7.4）共同培養(yǎng)30分鐘。細(xì)胞DNA染色用碘化丙錠（PI），流式細(xì)胞儀分析測(cè)定細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布，Cellquest軟件獲取熒光信號(hào)，采用Mod fit LT2.0軟件分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用析因設(shè)計(jì)資料方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 MTT篩選結(jié)果

（1）不同濃度吉西他濱對(duì)T 24細(xì)胞均有抑制作用，且呈濃度依賴(lài)性，結(jié)合臨床考慮10ug/m l吉西他濱毒性過(guò)大,故采用1.00ug/m l為吉西他濱最佳濃度進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1）。

（2）同一比例（VC：VK3=100：1）不同濃度的VC＋VK3與1.00ug/m l吉西他濱聯(lián)用，培養(yǎng)72h后，發(fā)現(xiàn)不同濃度的VC+VK3均增強(qiáng)吉西他濱對(duì)T24細(xì)胞的抑制作用，且呈濃度依賴(lài)性，其中1000：10um ol/L組的抑制最為明顯，故選用該濃度進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表2）。

2.2 吉西他濱聯(lián)用VC+VK3對(duì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布的影響

結(jié)果顯示，作用72h后，吉西他濱聯(lián)合VC+K3組為（41.39±1.04）％,吉西他濱組為（9.23±1.08）％，VC+VK3組為（17.42±1.09）％,空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.92±0.76）％。各藥物組與對(duì)照組相比差異均有顯著性（P＜0.05），聯(lián)合用藥組與單藥組相比差異有顯著性（P＜0.05）（見(jiàn)圖1）。

表1 不同濃度吉西他濱對(duì)T24細(xì)胞增殖的抑制作用Tab1 The inhibitory effects of different concentration of gem citabine

表2 吉西他濱聯(lián)用不同濃度VC+VK3對(duì)T24細(xì)胞增殖的抑制作用Tab2 The inhibitory effects of the combination of gem citabine and VC+VK 3

表3 各組對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響（％）Tab3 The influence on cell cycle and apoptosis of each group（％）

注：與對(duì)照組相比，*為P＜0.05；與吉西他濱組相比，△為P＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各藥物組的細(xì)胞凋亡率Fig1 The cell apoptosis rates of each group

方差分析結(jié)果顯示，吉西他濱組的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組（P＜0.05）；VC+VK3組的主效應(yīng)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；二者之間的交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。據(jù)專(zhuān)業(yè)知識(shí)，凋亡率越大示藥物凋亡作用越強(qiáng)，由表3知,聯(lián)合用藥組凋亡作用強(qiáng)于吉西他濱、VC+VK3單藥組，可認(rèn)為吉西他濱與VC+VK3有協(xié)同作用，VC+VK3增強(qiáng)吉西他濱誘導(dǎo)人膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的作用。表3示聯(lián)合用藥對(duì)S期阻滯作用顯著。

3 討論

膀胱腫瘤的發(fā)病率國(guó)內(nèi)居泌尿系腫瘤第一位?；熓俏ㄒ荒苎娱L(zhǎng)晚期膀胱腫瘤患者生存時(shí)間并改善其生活質(zhì)量的治療方法,可使多數(shù)患者的預(yù)計(jì)生存時(shí)間由3～6個(gè)月延長(zhǎng)至1年左右,少數(shù)病人可獲得長(zhǎng)期生存[2]。吉西他濱是一種新型脫氧胞苷類(lèi)似物,具有抗瘤譜廣、作用機(jī)制獨(dú)特、毒性反應(yīng)低、與其他化療藥物無(wú)交叉耐藥且毒性反應(yīng)無(wú)疊加等特點(diǎn)。姚旭東等研究了吉西他濱對(duì)膀胱癌細(xì)胞系增殖、細(xì)胞周期及凋亡的作用，證實(shí)吉西他濱對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分化低、倍增時(shí)間短的癌細(xì)胞系對(duì)吉西他濱更敏感[3]。目前在晚期膀胱癌治療中，吉西他濱已成為化療的一線藥物,較常見(jiàn)的是吉西他濱聯(lián)合順鉑方案，但因?yàn)樵摲桨傅哪I毒性限制了其在高齡及有腎功能和潛在腎功能損傷患者中的應(yīng)用。

近年來(lái)的研究顯示,維生素C和維生素K3在治療或作為輔助藥聯(lián)合其他抗癌藥物治療惡性腫瘤方面具有潛在價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了吉西他濱與VC+VK3的協(xié)同作用。維生素C作為一種抗氧化劑，在體內(nèi)可以和氧自由基結(jié)合發(fā)生還原反應(yīng),清除有害的氧自由基,保護(hù)細(xì)胞的DNA免受氧化損傷；大劑量的VC還對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制及殺傷作用。Mu ralik rishnan等在實(shí)驗(yàn)中觀察到維生素C可抑制環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤及5-氟尿嘧啶引起的血漿脂質(zhì)代謝異常,起到保護(hù)化療個(gè)體的作用[4]。Blasiak等的研究中檢測(cè)順鉑及三氧化硒造成的細(xì)胞及基因毒性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)維生素C的保護(hù)作用,而對(duì)DNA修復(fù)的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)無(wú)明顯影響,故認(rèn)為維生素C有助于減輕抗癌藥物的副作用[5]。有細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)表明,低濃度的維生素C對(duì)纖維細(xì)胞瘤細(xì)胞SW 620有一定保護(hù)作用,而高劑量則對(duì)瘤細(xì)胞有殺傷作用,因維生素C對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用和能降低抗腫瘤藥對(duì)機(jī)體的損傷而被建議作為腫瘤輔助治療藥物。維生素K3為人造的維生素K1衍生物，通過(guò)醌的氧化還原反應(yīng)使體內(nèi)活性氧簇（ROS）生成增多，超過(guò)細(xì)胞氧化承受能力，引起細(xì)胞死亡。維生素K3與其他維生素聯(lián)合應(yīng)用引起的細(xì)胞毒作用可能與上述的氧化還原反應(yīng)有關(guān)[6]。在體外實(shí)驗(yàn)中，加入維生素C可以增強(qiáng)維生素K3的毒性，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生[7]。Noto等證實(shí)維生素C和維生素K3以100：1的比例下聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)人類(lèi)乳腺癌的抑制作用顯著增強(qiáng)[1]。聯(lián)用時(shí)，二者可以在低于常規(guī)10到50倍的劑量下協(xié)同作用抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)藥物毒性也相應(yīng)減少了[1]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：聯(lián)合用藥組為（41.39±1.04）％，吉西他濱組培養(yǎng)72h后，其凋亡率為（9.23±1.08）％，與吉西他濱組相比差異有顯著性（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組誘導(dǎo)凋亡作用明顯高于吉西他濱組，證實(shí)維生素C和維生素K3增強(qiáng)了吉西他濱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。這與Kassou f等在UMUC-14等細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)相符[8]。

目前對(duì)維生素C和維生素K3誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的明確機(jī)制仍不清楚，有待深入研究。為了探討聯(lián)合用藥誘導(dǎo)凋亡可能的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)得了藥物處理后的細(xì)胞周期分布，發(fā)現(xiàn)吉西他濱如其藥理學(xué)特性，主要作用于S期（46.78±3.6）％，吉西他濱聯(lián)用VC+VK3后，S期阻滯明顯增高（57.50±2.5）％，可見(jiàn)VC＋K3增強(qiáng)吉西他濱誘導(dǎo)T 24細(xì)胞凋亡可能與細(xì)胞周期阻滯于S期有關(guān)，其進(jìn)一步機(jī)制有待深入研究。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VC+VK3增強(qiáng)吉西他濱對(duì)膀胱腫瘤T24細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。其機(jī)制可能包括維生素的氧化還原作用形成H2O2、氧化應(yīng)激、DNA損傷和細(xì)胞膜損傷,在其過(guò)程中一些關(guān)鍵性蛋白的磷酸化水平改變導(dǎo)致的細(xì)胞核因子κB（NF-κB）的活化抑制是細(xì)胞內(nèi)主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。在Bach leitner-Hofmann等用維生素C和三氧化二砷（As2O3）共培養(yǎng)急性前髓細(xì)胞性白血?。ˋPL）細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)維生素C并不是抗腫瘤細(xì)胞凋亡,而是協(xié)同A s2O3誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡[9]。Verrax等研究也表明維生素C能協(xié)同維生素K3殺傷腫瘤細(xì)胞,并指出主要是因?yàn)槟芗せ钅[瘤細(xì)胞死亡所需的酸性或堿性DNase,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡或死亡[7]。同時(shí)該研究中還觀察到一種新型的細(xì)胞死亡類(lèi)型，自凋亡（auto sch izis）[7,10]。Gilloteaux等將維生素C與維生素K3同加入培養(yǎng)的膀胱癌細(xì)胞系T24中,也觀察到這種不同于凋亡的死亡類(lèi)型[11]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明吉西他濱聯(lián)合維生素C和維生素K3協(xié)同作用于人膀胱癌T 24系細(xì)胞增殖，VC+VK3增強(qiáng)吉西他濱誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，為臨床聯(lián)合用藥提供了依據(jù)和指導(dǎo)。

[1]Noto,V.,Taper,H.S.,Jiang,Y.H.,et al.Effects of sodium ascorbate（vitamin C）and 2-methyl-1,4-naphthoquinone（vitamin K3）treatment on human tumor cell growth in vitro.I.Synergism of combined vitaminC and K3action[J].Cancer,1989,63：901.

[2]HussainSA,JamesND.The systemictreatment of advanced and metastatic bladder cancer[J].LancetOncol,2003,4：489-497.

[3]姚旭東,葉定偉,朱江,等.吉西他濱對(duì)膀胱癌細(xì)胞系增殖、細(xì)胞周期、凋亡的影響[J].中國(guó)癌癥雜志,16（12）：1019-1022.

[4]Muralikrishnan G,Amalan S V,Sadasivan P K.Dual role of vitamin C on lipid profile and combined application of cyclophos-phamide,methotrexate and 5-fluorouracil treatment in fibrosarcoma bearing rats[J].Cancer Lett,2001,169（2）：115-120.

[5]Blasiak J,Kowalik J.Protective action of vitamin C against DNA damage induced by selenium cisplatin conjugate[J].Acta Biochim Pol,2001,48（1）：233-240.

[6]Taper H.S.,Roberfroid M.Non-toxic sensitization of cancer chemotherapy by combined vitamin C and K3pretreatment in a mouse tumor resistant to oncovin[J].Anticancer Res,1992,12：1651-1654.

[7]Verrax,J.,Cadrobbi,J.,Delvaux,M.,et al.The association of vitamins C and K3kills cancer cells mainly by autoschizis,a novel form of cell death.Basis for their potential use as coadjuvants in anticancer therapy[J].Eur J Med Chem,2003,38：451.

[8]Kassouf,Wassim.Vitamins C and K3Sensitize Human Urothelial Tumors to Gemcitabine[J].Journal of Urology,2006,176（4）：1642-1647.

[9]Bachleiyner-Hofmann T,Gisslinger B,Grumbeck E,et al.Arsenic trioxide and ascorbic acid：energy potential implications for the treatment of acute myeloid leukemia？[J].Br J Haematol,2001,112（3）：783-786.

[10]Jamison,J.M.,Gilloteaux,J.,Taper,H.S.,et al.Autoschizis：a novel cell death[J].Biochem Pharmacol,2002,63（10）：1773.

[11]Gilloteaux J,Jamison JM,Arnold D,et al.Ultrastructural aspects of autoschizis：a new cancer celldeath induced by the synergistic action of ascorbate/menadione on human bladder carcinoma cells[J].Blood，2001,18（2）：183-192.