李超，高婷，陳廣泉，姚凡，葛丹梅，金鋒

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院乳腺外科，沈陽(yáng) 110001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所第二研究室，沈陽(yáng) 110001；3.沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院 普通外科，沈陽(yáng) 110031；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽(yáng) 110001）

基底樣乳腺癌與ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)系的研究

李超1，高婷2，陳廣泉3，姚凡1，葛丹梅4，金鋒1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院乳腺外科，沈陽(yáng) 110001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所第二研究室，沈陽(yáng) 110001；3.沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院 普通外科，沈陽(yáng) 110031；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽(yáng) 110001）

目的 檢測(cè)三陰性乳腺癌中CK5/6，EGFR，P-ERK的表達(dá)，探討基底細(xì)胞樣乳腺癌與ERK/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)系。方法 采用免疫組化法檢測(cè)CK5/6，EGFR，P-ERK在70例三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)。結(jié)果 在（70例）三陰性乳腺癌中，CK5/6與EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率分別為68.6%（48/70），57.1%（40/70），共篩出基底細(xì)胞樣乳腺癌53例。在三陰性乳腺癌中P-ERK在基底細(xì)胞樣乳腺癌與非基底細(xì)胞樣乳腺癌的陽(yáng)性表達(dá)率分別為79.2%（42/53），47.1%（8/17），其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CK5/6與EGFR、P-ERK在基底細(xì)胞樣乳腺癌的表達(dá)中具有正相關(guān)性（r=0.471；0.389，P<0.05）。結(jié)論 CK5/6，EGFR是診斷基底細(xì)胞樣乳腺癌的重要分子標(biāo)記物；基底細(xì)胞樣乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與ERK/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路被異常激活有關(guān)；CK5/6與EGFR、P-ERK在基底細(xì)胞樣乳腺癌的表達(dá)中具有相關(guān)性。

基底細(xì)胞樣乳腺癌；免疫組化；CK5/6；EGFR；P-ERK

近年來(lái)，基底細(xì)胞樣型乳腺癌（basal-like breast carcinoma，BLBC）被廣泛研究，其因具有更短生存期和更突出的臨床病理特點(diǎn)而被看作獨(dú)立的臨床病種。這部分乳腺癌常表現(xiàn)為雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epiderl growth factor receptor-2，HER2） 均陰性，且CK5/6和（或）EGFR表達(dá)陽(yáng)性［1，2］。但基底細(xì)胞樣乳腺癌與三陰性乳腺癌（triple negative breast carcinoma，TNBC）并不完全相同［3～5］，根據(jù)基因表達(dá)譜分析，TNBC不僅包括基底細(xì)胞樣亞型，還包括正常乳腺樣型［6］，即TNBC中不表達(dá)CK5/6與EGFR的亞型（TN3BKE-）。有文獻(xiàn)報(bào)道該亞型對(duì)于新輔助化療敏感性不及BLBC，但預(yù)后較BLBC好［7～9］。

P-ERK（phospho-ERK），即磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，是ERK的活化形式。ERK信號(hào)途徑可被許多生長(zhǎng)因子、細(xì)胞素及激素和介導(dǎo)有絲分裂、分化的信號(hào)所激活，發(fā)生磷酸化而活化，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期并促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，并能抵制細(xì)胞調(diào)亡。因此，ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［12］。本研究通過(guò)檢測(cè)BLBC與TN3BKE-中PERK的表達(dá)情況，探討B(tài)LBC與ERK/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)系，意在進(jìn)一步明確ERK途徑在BLBC發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的意義，并為該亞型乳腺癌患者的預(yù)后提供有益的參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科2006年1月至2009年12月存檔并且免疫組化檢測(cè)ER、PR及HER2均陰性的乳腺癌（即三陰性乳腺癌）病例70例，以上病例均由本院及同等級(jí)別醫(yī)院病理醫(yī)師對(duì)全部切片進(jìn)行復(fù)查確診。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化：每例切片厚4μm，置于涂有蛋白膠的玻片上。用PV9000二步法進(jìn)行免疫組化染色。選用以下單克隆抗體：ER、PR、HER2、PV9000試劑盒及DAB均購(gòu)自北京中杉金橋生物開(kāi)發(fā)有限公司。CK5/6、EGFR購(gòu)自Abcam公司。P-ERK購(gòu)自Santa公司。

1.2.2 陽(yáng)性判定：實(shí)驗(yàn)結(jié)果由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師判定。陽(yáng)性物質(zhì)為棕黃色，CK5/6、ERFR陽(yáng)性物質(zhì)分別位于胞膜、胞質(zhì)內(nèi)［11］，P-ERK位于細(xì)胞核［12］，ER、PR位于細(xì)胞核，HER2位于細(xì)胞膜。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為陰性，5%～25%為（+），26%～50%為（++），>50%為（+++）；ER按Allerd評(píng)分法；HER2按美國(guó)臨床腫瘤協(xié)會(huì)乳腺癌HER2檢驗(yàn)指南判定。在數(shù)據(jù)分析時(shí)，將（+～+++）均歸為陽(yáng)性組判斷。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS13.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 BLBC、TN3BKE-的篩出

BLBC診斷標(biāo)準(zhǔn)：ER、PR、HER2均為陰性，且CK5/6和（或）EGFR表達(dá)陽(yáng)性［1，2］。

TN3BKE-診 斷 標(biāo) 準(zhǔn) ：ER、PR、HER2、CK5/6、EGFR均為陰性［9］。

按上述診斷標(biāo)準(zhǔn)在70例三陰性乳腺癌中共篩出BLBC53例，TN3BKE-17例。

2.2 CK5/6，EGFR在TNBC及BLBC中的表達(dá)

CK5/6在胞膜中表達(dá)（圖1A），在TNBC中陽(yáng)性表達(dá)48例，陽(yáng)性率為68.6%（48/70）；EGFR在胞漿中表達(dá)（圖1C），在TNBC中陽(yáng)性表達(dá)40例，陽(yáng)性率為57.1%（40/70）。篩出BLBC53例，其中CK5/6，EGFR在BLBC中陽(yáng)性率分別為90.6%（48/53），75.5%（40/53）。

2.3 P-ERK在BLBC與TN3BKE-中的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)顯示，P-ERK在胞核中表達(dá)（圖1B），在BLBC中陽(yáng)性表達(dá)42例，陽(yáng)性率為79.2%（42/53）,而在TN3BKE-中陽(yáng)性表達(dá)8例，陽(yáng)性率為47.1%（8/17），其差異有顯著意義（χ2=5.05，P<0.05）。

2.4 CK5/6、EGFR和P-ERK相關(guān)性分析

Spearman等級(jí)相關(guān)分析（表1）。

表1 CK5/6、EGFR和P-ERK相關(guān)性分析Tab.1 The correlate analysis between CK5/6，EGFRand P-ERK

圖1 CK5/6、EGFR及P-ERK在三陰性乳腺癌中的表達(dá)Fig.1 Expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin triple negative carcinoma

3 討論

基底細(xì)胞樣乳腺癌是指具有基底細(xì)胞基因表型并不同程度的表達(dá)基底細(xì)胞角蛋白和肌上皮標(biāo)志物的一種特殊類型的乳腺癌。Sorlie等［7］對(duì)多組基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，將乳腺癌分為5種亞型，即管腔A型（luminal subtype A），管腔 B型（luminal subtype B）、正常乳腺樣型 （normal breast-like subtype）、HER2過(guò)表達(dá)型（HER2over-expression subtype）及基底細(xì)胞樣型（basal-like subtype）。BLBC約占全部乳腺癌的10%～20%，占高級(jí)別乳腺癌的25%。BLBC的臨床行為具有較高的增殖活性和高度的侵襲性。BLBC的轉(zhuǎn)移方式與其他乳腺癌也不盡相同，它們較少轉(zhuǎn)移到腋窩淋巴結(jié)和骨，而更傾向于通過(guò)血道轉(zhuǎn)移至腦和肺［13］。

目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CK5/6是確定BLBC最有效的標(biāo)記物，本研究BLBC中CK5/6陽(yáng)性率為90.6%，敏感性較高，因此CK5/6是診斷BLBC有價(jià)值的標(biāo)記物。EGFR作為一種上皮生長(zhǎng)因子受體，可能與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)激酶有關(guān)，特別是有絲分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT），他們與細(xì)胞增殖加速和細(xì)胞生存期延長(zhǎng)密切相關(guān)，從而促進(jìn)乳腺腫瘤的形成及發(fā)展，BLBC中EGFR高表達(dá)與其預(yù)后較差密切相關(guān)［14］。本研究BLBC中EGFR陽(yáng)性率為75.5%，且均為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，提示EGFR在BLBC的腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

ERK相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路被認(rèn)為是經(jīng)典的MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑?，F(xiàn)已證明多種細(xì)胞外信號(hào)通過(guò)不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子和信號(hào)通路活化ERK，傳統(tǒng)的ERK活化模式可簡(jiǎn)單的概括為：各種生長(zhǎng)因子、激素等→受體→Ras→Raf→MEK→ERK。Ras/Raf/MEK/ERK細(xì)胞信號(hào)傳遞通路是由一個(gè)小GTP蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋白組成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。ERK異?；罨瘜?dǎo)致細(xì)胞分化、凋亡功能的喪失，引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、異常增殖、腫瘤發(fā)生、侵襲能力增強(qiáng)，ERK被磷酸化后，其活性增強(qiáng)100倍以上，最終導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。

有研究表明，非磷酸化的ERK在胞漿中與其上游的激活物MEK形成復(fù)合物，當(dāng)ERK/MAPK通路被激活時(shí)，復(fù)合物解離，ERK被磷酸化而轉(zhuǎn)入核內(nèi)。本研究顯示，P-ERK陽(yáng)性信號(hào)位于細(xì)胞核內(nèi)，在基底細(xì)胞樣乳腺癌中P-ERK的陽(yáng)性率為79.2%，在非基底細(xì)胞乳腺癌中P-ERK的陽(yáng)性率為47.1%，其差異有顯著意義（P<0.05）。說(shuō)明基底細(xì)胞樣乳腺癌與ERK/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路之間確有關(guān)系，表明ERK途徑的過(guò)度激活在基底細(xì)胞樣乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

本研究顯示CK5/6與EGFR有互相接近的陽(yáng)性表達(dá)率，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理發(fā)現(xiàn)兩者之間有正相關(guān)關(guān)系。此外本研究還發(fā)現(xiàn)CK5/6與P-ERK在基底細(xì)胞樣乳腺癌的表達(dá)中具有正相關(guān)性，進(jìn)一步提示基底細(xì)胞樣乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與ERK/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路被異常激活有關(guān)。

目前，腫瘤的治療愈趨個(gè)體化。然而，BLBC中ER、PR、HER2陰性表達(dá)，因此抗激素治療及赫賽?。℉erceptin）治療效果不佳。對(duì)于這類乳腺癌，唯一的治療方案為系統(tǒng)性化療，尋找新的治療靶點(diǎn)尚在摸索階段。希望本研究能夠指導(dǎo)臨床，對(duì)基底細(xì)胞樣乳腺癌患者通過(guò)藥物等干擾ERK/MAPK通路的激活，來(lái)阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。

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（編輯 孫憲民，英文編輯 趙傳勝）

Relationship between Basal-like Breast Carcinoma and ERKSignal Transduction Pathway

LIChao1，GAOTing2，CHENGuang-quan3，YAOFan1，GEDan-mei4，JINFeng1
（1.Department of Breast Suregry，The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001；2.The second laboratory，Cancer research Institutem The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001；3.Department of Generral Sugery，The Fourth Hospital of People，Shenyang 110031；4.Departmet of Nephrology，The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo detect the expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin triple negative breast carcinoma and to probe into the relationship between basal-like breast carcinoma and ERK/MAPKsignal transduction pathway.MethodsTo detect the expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin 70cases of triple negative breast carcinoma by using immunohistochemistry （IHC）.ResultsIn 70cases of triple negative carcinoma，the positive rates of CK5/6and EGFRwere 68.6%（48/70）and 57.1%（40/70）respectively，and a total of 53cases of basal-like breast carcinoma were screened out.In triple negative breast carcinoma，the positive rate of P-ERKin basal-like breast carcinoma and non-basal-like breast carcinoma were 79.2%（42/53）and 47.1%（8/17）respectively，their difference was of statistical significance（P<0.05）.There was a positive correlation among expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin basal-like breast carcinoma（r=0.471；0.389，P<0.05）.ConclusionCK5/6and EGFRcan be used as important molecular markers for diagnosing basal-like breast carcinoma；occurrence and development of basal-like breast carcinoma relates to aberrant activation of ERK/MAPKsignal transduction pathway；and there is a correlation among expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin basal-like breast carcinoma.

basal-like breast carcinoma；inmunohistochemistry；CK5/6；EGFR；P-ERK

R737.9

A

0258-4646（2010）12-1067-03

李超（1984-），男，碩士研究生.

金鋒，E-mail：jinfeng66cn@hotmail.com

2010-06-30