王玉霞，孔令芳，王雪鷹，宋玉萍，柳越

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 110001）

IL-6基因-572C/G多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性

王玉霞，孔令芳，王雪鷹，宋玉萍，柳越

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 110001）

目的 探討白介素-6（IL-6）基因-572C/G多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性。方法 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)，對358例2型糖尿病患者（2型糖尿病組）和326例非糖尿病對照人群（對照組）的IL-6基因-572C/G多態(tài)性基因型進行對照分析。結(jié)果IL-6基因-572GG基因型在2型糖尿病組和對照組的頻率分別為4.7%和1.84%（χ2=4.797，P=0.029），兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論IL-6基因-572GG型可能是2型糖尿病的易感基因之一。

2型糖尿?。话捉樗?6基因；基因多態(tài)性

2型糖尿?。╰ype 2diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)生是一個多因素、多步驟的過程，免疫系統(tǒng)的慢性低度激活可能是胰島素抵抗和T2DM發(fā)病的決定因子［1］。白細(xì)胞介素 6（interleukin-6，IL-6）是體內(nèi)與內(nèi)分泌關(guān)系最為密切的炎性因子［2］，IL-6水平在T2DM和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)時升高［3］。因此，IL-6水平升高和作用增強可能在T2DM的發(fā)病中具有重要作用。國外文獻報道，IL-6基因（rs1800795）啟動子-572C/G多態(tài)性與2型糖尿病及糖尿病腎病的嚴(yán)重程度相關(guān)［4］。目前我國尚未有該基因多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性報道。本研究旨在觀察我國遼寧地區(qū)漢族人群T2DM與IL-6基因-572C/G多態(tài)性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

遵循知情自愿的原則，在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院選取健康體檢者及2型糖尿病患者共684人，分為：（1）正常對照組（NGT，n=326），排除有糖尿病家族史者；（2）2型糖尿病組（DM，n=358），排除1型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病及合并有其他自身免疫性疾病者，患者間彼此均無親緣關(guān)系。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)采用1999年WHO推薦的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 一般情況檢查：測量身高、腰圍、臀圍及體質(zhì)量，計算體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI），BMI=體質(zhì)量（kg）/身高的平方（m2）。測量收縮壓和舒張壓。

1.2.2 基因組DNA的提取：抽取每位入選者外周血2ml，用酚氯仿方法提取基因組DNA。

1.2.3 基因多態(tài)性檢測：應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測IL-6基因-572C/G多態(tài)性。Taq DNA聚合酶PCR反應(yīng)試劑盒及Mbi-l內(nèi)切酶均購自上海生工公司。瓊脂糖試劑購自北京華美生物工程公司。上、下游引物由上海生工公司合成。上游引物：5′GGAGACGCCTTGAAGTAACTGC3′，下游引物 5′GAGTTTCCTCTGACTCCATCGCAG3′。PCR反應(yīng)體系為50μl，包括：30.6μl去離子水，5μl緩沖液，1μl Mg2+，4μl dNTP，上游及下游引物各 2μl，5μl模板，0.4μl Taq酶。PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃45s，61℃45s，72℃ 45s，30個循環(huán)；72℃ 10min。PCR擴增產(chǎn)物片斷長為163bp，取5μl PCR擴增產(chǎn)物行2﹪瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)呈現(xiàn)163bp特異PCR擴增產(chǎn)物后，繼以限制性內(nèi)切酶Mbi-l 37°C酶切4h。取酶切產(chǎn)物10μl行2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結(jié)果，照像并進行基因型分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

運用基因計數(shù)法計算各組基因型頻率和等位基因頻率，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，各組基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 2型糖尿病組和正常對照組臨床資料的比較

2型糖尿病組和對照組年齡、性別、身高、體質(zhì)量及BMI無統(tǒng)計學(xué)差異。兩組間腰圍、臀圍及腰臀比無統(tǒng)計學(xué)差異。2型糖尿病組收縮壓及舒張壓均較對照組增高，但無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

表1 2型糖尿病組和正常對照組一般特征比較（±s）Tab.1 Comparison of general condition between control and T2DMgroups（x ±s）

表1 2型糖尿病組和正常對照組一般特征比較（±s）Tab.1 Comparison of general condition between control and T2DMgroups（x ±s）

BMI，body mass index；WHR，waist-to-hip ratio；SBP，systolic blood pressure；DBP，diastolic blood pressure.

Group n Age（year） Male/female BMI（kg/m2） WHR SBP（mmHg） DBP（mmHg）Control 326 52±9 172/154 24.12±1.90 0.83±0.08 109.89±14.26 72.16±5.78T2DM 358 54±8 194/164 25.83±2.01 0.86±0.06 123.21±13.42 74.28±8.46

2.2 基因型判斷

IL-6基因-572位點胞嘧啶（C）被鳥嘌呤（G）置換后，使其成為限制性內(nèi)切酶Mbi-l的一個酶切位點，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)Mbi-l消化后，根據(jù)消化片段大小即可檢出IL-6基因-572位點的3種基因型：（1）-572G/G純合子，擴增的基因片段含Mbi-l酶切位點，可被完全消化為 101bp、62bp 2條片段；（2）-572C/G雜合子，出現(xiàn) 163bp、101bp、62bp 3條片段；（3）-572C/C純合子，擴增的基因片段不含Mbi-l酶切位點，電泳后只有163bp 1條片段。見圖1。任選樣本測序，與酶切結(jié)果相符。見圖2。

圖1 PCR-RFLP酶切結(jié)果Fig.1 PCR-RFLPdigestion results

2.2 IL-6基因-572C/G基因型頻率和等位基因頻率在2型糖尿病組和對照組的分布

圖2 基因測序圖譜Fig.2 Sequencing picture of three genotype

兩組研究對象中，IL-6基因-572位點均存在C/C、C/G、G/G3種基因型，3種基因型頻率依次減少，2型糖尿病組基因型頻率分布與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（χ2＝5.012，P＝0.082）；C/C與 C/G基因型合并后與 G/G基因型相比有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2＝4.44，P＝0.035），見表2。G/G基因型頻率糖尿病組高于對照組，C/C基因型頻率低于對照組，G/G基因型與C/C基因型相比有差異（χ2＝4.797，P＝0.029）。以 C/C基因型為對照，暴露于G/G基因型的OR值是2.78（P＜0.05）。等位基因G與C兩組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，見表3。結(jié)果提示，攜有G/G基因的個體患2型糖尿病的風(fēng)險顯著增加。

3 討論

胰島素抵抗是2型糖尿病的基本特征之一，研究可能導(dǎo)致該結(jié)果的候選基因或表達異常是探討T2DM遺傳因素的重要途徑。研究證明，胰島素抵抗與循環(huán)中免疫標(biāo)志物水平的變化、慢性炎癥等有關(guān)［5］。IL-6水平在T2DM和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)時升高。IL-6被認(rèn)為是糖尿病發(fā)病的獨立危險因素，它能減少細(xì)胞表面葡萄糖轉(zhuǎn)運體4的表達，從而降低脂肪細(xì)胞由胰島素介導(dǎo)的葡萄糖、脂肪轉(zhuǎn)運，促進糖尿病的發(fā)生。IL-6還可降低胰島素受體底物1酪氨酸磷酸化及下游磷脂酰肌醇-3-激酶活性，導(dǎo)致胰島素抵抗［6］。但血清IL-6水平升高究竟是T2DM的發(fā)病原因還是結(jié)果目前觀點不一致。一方面，胰島素能夠通過多種機制促進IL-6水平升高［7］。另一方面，IL-6可作為急性反應(yīng)的始發(fā)因子，影響糖尿病的發(fā)病，并且通過與胰島素相互作用而影響2型糖尿病的發(fā)生［8］。

表2 IL-6基因-572C/G基因型和等位基因在2型糖尿病組和對照組的分布Tab.2 Distribution frequency ofIL-6genotype and allele in T2DMand control groups

表3 IL-6-572C/G基因型、等位基因與2型糖尿病的風(fēng)險比較Tab.3 Risk comparison ofIL-6-572C/Ggenotype，allele for T2DM

IL-6基因表達主要在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)節(jié)。IL-6基因啟動子區(qū)的基因變異，可導(dǎo)致個體間IL-6基因轉(zhuǎn)錄與表達的差異，從而影響到個體對IL-6相關(guān)性疾病的易感性，而成為一些疾病發(fā)生發(fā)展的遺傳相關(guān)因子。IL-6基因-572C/G多態(tài)性是IL-6基因啟動子區(qū)研究較多的單核苷酸多態(tài)性。Terry等［9］發(fā)現(xiàn)，IL-6基因-572位點對IL-6的基因轉(zhuǎn)錄有調(diào)控功能，其多態(tài)性可能影響IL-6的水平。2型糖尿病與有功能的IL-6基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性研究將有可能提示炎癥及IL-6水平的升高是T2DM發(fā)病的原因而非結(jié)果，而且有助于解釋一些個體易患糖尿病的原因。

本研究運用PCR-RFLP方法檢測了2型糖尿病患者和正常對照者的IL-6基因-572C/G多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-6基因-572基因型頻率在兩組中有差異，2型糖尿病與IL-6基因-572C/G多態(tài)性有關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)，572G/G基因型患糖尿病的風(fēng)險是C/C基因型的 2.78倍，（95%CI：1.08～7.19，P=0.029），而C/G基因型與C/C基因型相比，患糖尿病的風(fēng)險性無明顯增加，C等位基因攜帶者與G等位基因攜帶者患糖尿病的風(fēng)險性無統(tǒng)計學(xué)差異。提示2型糖尿病的發(fā)病可能與IL-6基因572C/G多態(tài)性有關(guān)。572G/G基因型可能是2型糖尿病的遺傳危險因素及易感基因。本研究結(jié)果與Nieto等［10］的結(jié)果一致，提示IL-6基因多態(tài)性可能是2型糖尿病發(fā)生的遺傳危險因素，這些研究可能有助于解釋一些無糖尿病發(fā)生的傳統(tǒng)危險因素的人群易患糖尿病的原因，而且從基因水平證實了炎癥參與了2型糖尿病的發(fā)生，強調(diào)了炎癥在2型糖尿病發(fā)病中的作用，為2型糖尿病的抗炎治療提供了理論依據(jù)。

［1］Pickup JC.Inflammation and activated innate immunity in the pathogenesis of type 2diabetes［J］.Diabetes Care，2004，27（11）：813-823.

［2］Papanicolaou DA，Vgontzas AN.Interleukin-6：the endocrine cytokine［J］.JClin Endocrinol Metab，2000，85（3）：1331-1333.

［3］Herder C，Peltonen M，Koenig W，et al.Systemic immune mediators and lifestyle changes in the prevention of type 2diabetes：results from the Finnish Diabetes Prevention Study［J］.Diabetes，2006，55（8）：2340-2346.

［4］Koh SJ，Jang Y，Hyun YJ，et al.The interleukin-6-572C-->Gpromoter polymorphism is associated with Type 2diabetes risk in Koreans［J］.Clin Endocrinol，2009，70（3）：238-244.

［5］Fernández-Real JM，Pickup JC.Innate immunity，insulin resistance and type 2diabetes ［J］.Trends Endocrinol Metab，2008，19（1）：10-16.

［6］Senn JJ，Kloverp PJ，Nowak IA，et al.Interleukin-6induces cellular insulin resistance in hepatocytes［J］.Diabetes，2002，51（12）：3391-3393.

［7］LaPensee CR，Hugo ER，Ben-Jonathan N.Insulin stimulates interleukin-signalingpathway ［J］.Endocrinology，2008，149（11）：5415-5542.

［8］陳益民，許志良，袁新旺，等.2型糖尿病患者血清IL-6、TNF的變化［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，14（3）：150-151.

［9］Terry CF，Loukaci V，Green FR.Cooperative influence of genetic poly-morphisms on interleukin-6transcriptional regulation［J］.JBiol Chem，2000，275（24）：18138-18144.

［10］Nieto-Vazquez I，F(xiàn)ernández-Veledo S，et al.Dual role of interleukin-6in regulating insulin sensitivity in murine skeletal muscle［J］.Diabetes，2008，57（12）：3211-3221.

（編輯 王又冬，英文編輯 趙傳勝）

The Association ofIL-6Gene 572C/GPolymorphism and Type 2Diabetes

WANGYu-xia，KONGLing-fang，WANGXue-ying，，SONGYu-ping，LIUYue
（Department of Endocrinology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the correlation of interleukin-6（IL-6）gene 572C/Gpolymorphism with type 2diabetes in Liaoning Han population.MethodsPolymerase chain reaction（PCR）-restriction fragment length polymorphism（RFLP）was used to determine the distribution of allele and genotype frequencies ofIL-6gene 572C/Gpolymorphism in 358type 2diabetes mellitus（T2DM） patients and 326cases without diabetes mellitus as control group.Case-contrast analysis was used to study theIL-6gene 572C/Gpolymorphism.ResultsThe frequence of IL-6gene 572GGgenotype in T2DMand control groups were 4.7%and 1.84%，and there was a significant difference between the two groups（χ2＝4.797，P＝0.029）.ConclusionIL-6gene 572GGgenotype may be a high risk of T2DM.

type 2diabetes mellitus；interleukin-6gene；gene polymorphism

R587.1，R394.3

A

0258-4646（2010）12-1045-03

遼寧省教育廳高?？蒲杏媱濏椖浚?0061009）

王玉霞（1967-），女，副主任醫(yī)師，博士研究生.

孔令芳，E-mail：cmu_klf@126.com

2010-09-28