狄正鴻，孫曉冬，王雅坤，陳洪鐸，高興華

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽110001）

人皮膚角質(zhì)形成細胞無血清原代培養(yǎng)方法的建立

狄正鴻，孫曉冬，王雅坤，陳洪鐸，高興華

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽110001）

目的 建立人皮膚角質(zhì)形成細胞體外無血清、無牛垂體提取物及無飼養(yǎng)細胞的原代培養(yǎng)方法。方法 應(yīng)用胰蛋白酶-EDTA冷溫兩步消化法消化健康青年包皮皮膚，獲取角質(zhì)形成細胞并置于無血清、無牛垂體提取物、成分確定的角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基中進行原代培養(yǎng)并傳代。通過觀察細胞形態(tài)和采用免疫組織化學方法鑒定及繪制生長曲線，分析、評價細胞質(zhì)量。結(jié)果該方法可穩(wěn)定獲得高純度、活性好的角質(zhì)形成細胞。原代角質(zhì)形成細胞可穩(wěn)定增殖2周左右，至少可穩(wěn)定傳代增殖5代。經(jīng)免疫組織化學方法鑒定，99%以上為角質(zhì)形成細胞。結(jié)論 冷溫兩步消化法及體外無血清原代培養(yǎng)技術(shù)可為科研工作提供足量高質(zhì)量的角質(zhì)形成細胞，是高效經(jīng)濟的獲得人角質(zhì)形成細胞的方法。

人類；皮膚；角質(zhì)形成細胞；無血清；無牛垂體提取物；原代培養(yǎng)

以往體外研究中人角質(zhì)形成細胞（keratinocyte，KC）多采用由KC經(jīng)人乳頭瘤病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)形成的具有永生性、與正常角質(zhì)形成細胞表型特性相似的HaCaT細胞系［1］。盡管作為體外培養(yǎng)及組織工程皮膚的種子細胞得到了廣泛應(yīng)用，但HaCaT細胞與人來源的皮膚原代角質(zhì)形成細胞（human primary keratinocyte，HPK）在細胞周期及生理、生化等方面具有多種顯著差別［2］，不能完全等同于HPK。近年來，隨著皮膚科學基礎(chǔ)研究及臨床治療技術(shù)的迅猛發(fā)展，HPK逐漸成為重要的研究工具，廣泛應(yīng)用于皮膚生理、病理、藥理、組織工程學及皮膚美容整形等多個領(lǐng)域。本研究旨在建立一種快速、高效、經(jīng)濟的HPK培養(yǎng)方法，為皮膚學科研工作提供足量高質(zhì)量的角質(zhì)形成細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織取材：健康無菌包皮組織取自于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科就診的、因包皮過長而施行外科手術(shù)的健康青年男性，年齡18～35歲，平均30歲。

1.1.2 主要試劑：無血清、無牛垂體提取物的成分確定的角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)液及0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA溶液（美國Gibco公司），青-鏈霉素溶液及不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液（美國HyClone公司），鼠抗人廣譜細胞角蛋白單克隆抗體MAB-0049（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司），免疫組織化學S-P試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 主要實驗儀器：CO2培養(yǎng)箱（美國Queue公司）；Olympus倒置相差顯微鏡、光學顯微鏡（日本Olympus公司）；全能型高性能離心機（日本SANYO公司）；超凈工作臺（蘇州安泰公司）；蒸汽高壓消毒箱（德國Eppendorf公司）；25cm2斜頸通氣蓋培養(yǎng)瓶及6孔板（美國BD公司）

1.2 方法

1.2.1 皮膚角質(zhì)形成細胞的分離及接種：（1）取材：無菌外科手術(shù)獲得包皮組織放于含1%青-鏈霉素溶液的PBS緩沖液中沖洗，去除血液。盡可能除凈真皮及皮下組織，將標本切成大約5mm×5mm的小塊。（2）消化：置于0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA中，4℃過夜。過夜后可容易分離出表皮部分，用剪刀盡量剪成細小的片狀，置于更新的0.05%胰蛋白酶-EDTA中37℃再消化5min，及時加適量血清終止消化。100目篩網(wǎng)過濾。濾液于4℃、1000r/min離心5min。PBS清洗細胞3次，去除血清。（3）接種：將獲得的細胞重懸于角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基，以1×106/ml密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中。3d后首次換液，此后根據(jù)細胞生長情況每3～5d換液1次。

1.2.2 HPK的傳代：出現(xiàn)較大較多HPK細胞島后可進行首次傳代。按常規(guī)的0.05%胰蛋白酶-EDTA消化法進行，1×105/ml密度接種。增殖到70%～80%左右融合時可進行再次傳代。

1.2.3 細胞質(zhì)量控制：通過倒置顯微鏡進行細胞形態(tài)學觀察，免疫組織化學法鑒定及繪制生長曲線分析、評價細胞質(zhì)量。免疫組織化學檢測：將HPK及首次傳代后的KC細胞接種于蓋玻片上爬片培養(yǎng)，染色前24h換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化表達角蛋白；取出玻片，室溫下用丙酮固定15min，PBS漂洗3次；3%過氧化氫于室溫作用10min，PBS漂洗3次；正常羊血清封閉，室溫30min；棄去封閉血清不洗，加入廣譜小鼠抗人角蛋白抗體工作液，4℃孵育過夜；PBS漂洗3次；加入生物素化兔抗小鼠IgG二抗及S-P復(fù)合物，室溫孵育各40min，PBS漂洗3次；DAB顯色5min；蘇木素復(fù)染核；常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片后光鏡下觀察。陰性對照在鑒定過程中沒有加入特異性一抗。生長曲線的繪制：HPK首次傳代后的歷代KC細胞進行無血清培養(yǎng)，1×105/ml密度接種于6孔板，每孔2ml，每日計數(shù)，繪制生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 KC的分離、接種及傳代

接種后1周左右出現(xiàn)明顯的HPK細胞島。倒置顯微鏡下正常的HPK細胞為橢圓形及多角形，呈鋪路石樣增殖排列。一般于接種后的2周內(nèi)形成較大、較多細胞島時可進行首次傳代（圖1）。首次傳代后的HPK細胞一般在增殖5d后達到80%左右融合，可穩(wěn)定傳代至少5代（圖2）。

圖1 接種后的HPK細胞形態(tài)學Fig.1 Morphology of HPKafter inoculation

圖2 傳代后的KC細胞的形態(tài)學 ×100Fig.2 Morphology of KCafter passage×100

2.2 免疫組織化學法進行HPK細胞的鑒定結(jié)果

免疫組織化學顯示HPK及其傳代細胞以多角形及類橢圓形為主，所有細胞的胞質(zhì)染色為棕黃色，為角蛋白陽性（圖3）。純度可達99%。

圖3 HPK細胞角蛋白免疫組織化學染色 DAB×400Fig.3 Cultured HPKidentified by immunohistochemistry with keratin antibody DAB×400

2.3 生長曲線的繪制

傳代KC以1.0×105/ml密度接種于6孔板，每孔2ml，細胞于第5天達到80%左右融合。生長曲線（圖4）中潛伏期、指數(shù)分裂期和平臺期分別為0～3、3～7和7～10d。細胞至少在傳代5次內(nèi)可穩(wěn)定增殖，細胞形態(tài)及生長曲線保持穩(wěn)定。傳代5代以上開始出現(xiàn)明顯的增殖速度變慢，細胞形態(tài)改變，表現(xiàn)為胞體變大、核模糊、出現(xiàn)空泡、死亡脫落。

2.4 常見污染細胞的形態(tài)學鑒別

最常見污染細胞為成纖維細胞，呈長梭狀、少分枝的細胞，可呈渦旋狀排列（圖5A）。其次為黑素細胞，為多角形、多樹枝狀粗大分枝的細胞（圖5B）。

圖4 傳代后KC的生長曲線Fig.4 Growth curve of KCafter passage

圖5 優(yōu)勢生長的成纖維細胞和黑素細胞×200Fig.5 Growth advantage of fibroblasts and melanocytes×200

3 討論

表皮干細胞（epidermal stem cell，ESC）主要集中于毛囊的隆突部及基底層突入真皮的表皮腳區(qū)域。大約1%～10%的皮膚基底層細胞是ESC，具有增殖潛能。正常生理狀態(tài)下表皮中的多潛能ESC先分化成定向祖細胞，定向祖細胞經(jīng)過一定分裂次數(shù)后進一步定向分化為終末分化細胞［3］。機體內(nèi)表皮干細胞正常狀態(tài)下多處于靜息狀態(tài)，在皮膚損傷或體外培養(yǎng)的情況下該細胞分裂、增殖才明顯加快。在體外擴增條件下，每個ESC約可進行140次分裂，約產(chǎn)生1040個子代細胞［4］，可穩(wěn)定培養(yǎng)2年左右，然而ESC含量少且提取培養(yǎng)技術(shù)復(fù)雜，具有分化為多種表皮細胞的潛能。而HPK培養(yǎng)細胞主要來源于ESC分化而來的定向祖細胞，雖體外增殖能力有限，但定向分化為KC細胞，純度高，可以很好地反映活體狀態(tài)下的皮膚KC的生理生化功能，因此成為皮膚生理、病理、藥理、組織工程學、皮膚美容整形等多領(lǐng)域研究的重要工具。自1967年Briggaman等成功地從人皮膚中分離KC，體外HPK研究一直受到關(guān)注，但HPK培養(yǎng)有不易貼壁、易分化以及其他細胞污染等問題較難克服。盡管KC于體外可采用經(jīng)致死量輻射的小鼠3T3成纖維細胞作為飼養(yǎng)細胞并添加血清的培養(yǎng)基可獲良好增殖，然而3T3細胞為異種細胞，可能對KC產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。使用異種動物血清的生物學風險也限制了這種培養(yǎng)細胞在臨床上的應(yīng)用，而且在血清的誘導(dǎo)下HPK細胞會加速分化，失去增殖能力。因此血清逐漸被用各種添加成分代替［5］，如采用牛垂體提取物作為原發(fā)性刺激增殖物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基。但牛垂體提取物作為最初的絲裂原具有較多缺陷：如牛垂體提取物成分復(fù)雜，使實驗結(jié)果不易解釋；不同濃度的牛垂體提取物對人KC具有刺激或抑制效應(yīng)，不利于細胞生理病理下各項調(diào)控機制的研究；牛垂體提取物在培養(yǎng)基中只可穩(wěn)定維持4周。因此無血清、無牛垂體提取物、無需飼養(yǎng)細胞確定成分培養(yǎng)基是最理想的培養(yǎng)基。本實驗采用了GIBCO公司成分確定的無血清、無牛垂體成分的培養(yǎng)基，該配方含有胰島素、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、低濃度的鈣離子，無需飼養(yǎng)細胞即可保證HPK的正常貼壁及傳代增殖，抑制分化，是目前HPK培養(yǎng)的較好培養(yǎng)基。

由于原代角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)時存在供體之間的差異，經(jīng)離體打擊后恢復(fù)分裂功能的能力不同，且可分裂的定向祖細胞存活數(shù)目不等，接種時要盡量以高密度進行接種，以保證有較多活性細胞的存在。首次換液時間以接種后2～3d為宜，以保證充分貼壁（圖1A）。首次傳代前可能需要1～2周（平均10～14d）后能夠增殖達到較大、較多的細胞島，表明細胞較好適應(yīng)體外培養(yǎng)的環(huán)境（圖1B）。原代培養(yǎng)的HPK傳代后，在單位面積內(nèi)接種密度一致的情況下，不同的細胞株間可獲得較為穩(wěn)定一致的生長形態(tài)（圖2）及生長曲線（圖4）。KC細胞在2～5代內(nèi)的細胞生長曲線基本一致。6代以上的細胞形態(tài)及生長周期發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為生長速度變慢、細胞形態(tài)變異、出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象等。證實原代培養(yǎng)的KC在3～5代內(nèi)進行實驗為最佳。這與既往文獻報道原代培養(yǎng)的生命周期在7代以內(nèi)的結(jié)論基本一致［6］。

為抑制HPK分化要注意如下情況：培養(yǎng)過程中要避免接觸血清，血清中和胰酶后要用PBS充分清洗；不同于HaCaT細胞系的是，鈣離子不僅可誘導(dǎo)KC分化，還能抑制HPK的增殖［7］，培養(yǎng)用液體要使用低鈣離子濃度培養(yǎng)基（本實驗所用培養(yǎng)基鈣離子濃度為0.09mmol/L），無鈣、鎂離子的PBS緩沖液；在細胞增殖及傳代過程中要避免細胞過度融合生長，及時傳代，以避免接觸抑制而導(dǎo)致分化。上述操作可保證細胞處于穩(wěn)定的增殖狀態(tài)。

HPK培養(yǎng)中的另一個較為常見的問題是細胞污染的問題。常見的污染細胞為成纖維細胞及黑素細胞。成纖維細胞從形態(tài)即可鑒別，為細長少分支的梭狀細胞（圖5A）。黑素細胞形態(tài)上與角質(zhì)形成細胞在初期相似，不易發(fā)現(xiàn)，但隨著培養(yǎng)時間的延長，表現(xiàn)為具有典型的較為粗大的樹枝樣分支（圖5B）。但本培養(yǎng)基不適合黑素細胞生長，其增殖速度明顯慢于KC，在有大量KC細胞存活的情況下，黑素細胞一般不易成活。發(fā)現(xiàn)的黑素細胞污染的個例中一般KC成活率不高，從而形成黑素細胞生長優(yōu)勢。如需進一步鑒定可采用多巴染色，簡便易行，如發(fā)現(xiàn)胞體內(nèi)明顯的黑素顆粒即為陽性。防止成纖維細胞污染較好的方法是在處理包皮組織時表真皮分離的過程中注意操作細節(jié)。如在細胞接種后發(fā)現(xiàn)成纖維細胞污染再進行處理，則一般方法較難徹底清除，傳統(tǒng)的差速消化以及刮除法效果均不理想。處理包皮組織時要盡量除去皮下及真皮組織，采用銳利剪刀修剪要好于刀片鈍性分離。真表皮層分離時采用0.25%胰酶-0.04%EDTA在4℃冷法消化過夜，優(yōu)于37℃溫熱消化，細胞存活率高，成纖維細胞污染少。而且EDTA成分可起到抑制成纖維細胞的活性及過度增殖作用。實驗中發(fā)現(xiàn)不同廠家生產(chǎn)的相同濃度的胰蛋白酶的效價可能相差很多，要注意使用濃度的摸索。過度消化會使HPK細胞不能成活，成纖維細胞污染機會增加。此外，表皮真皮分離亦可采用dispaseⅡ選擇性作用于半橋粒結(jié)構(gòu)，消化真皮及表皮的接觸層，可以完整的分離出表皮［8］，從而較好避免成纖維細胞的污染，但進口dispase價格昂貴，增加實驗成本。在進行表真皮分離時采用冷法消化，摸索出適宜的冷消化時間，盡量分離皮下及真皮組織，可較為成功的控制成纖維細胞污染的情況，降低實驗成本，操作熟練后成功率較高。

HPK培養(yǎng)的關(guān)鍵在于如何提高細胞分離數(shù)量，避免其他細胞污染，維持細胞穩(wěn)定的生物學活性，操作簡便，成本經(jīng)濟。本研究使用胰蛋白酶-EDTA，冷溫兩步消化法對人包皮皮膚組織進行消化分離，進而進行無血清培養(yǎng)，經(jīng)用廣譜單克隆抗角蛋白抗體免疫組化進行鑒定，99%以上為角質(zhì)形成細胞，未見成纖維細胞污染，生長曲線可見穩(wěn)定的指數(shù)增生期，可獲得較大量滿足臨床科研需要的角質(zhì)形成細胞。

［1］Boukamp P，Popp S，Altmeyer S，et al.Sustained nontumorigenic phenotype correlates with a largely stable chromosome content during long-term culture of the human keratinocyte line HaCaT［J］.Genes Chromosomes Cancer，1997，19（4）：201-214.

［2］Deyrieux AF，Wilson VG.In vitro culture conditions to study keratinocyte differentiation using the HaCaTcell line［J］.Cytotechnology，2007，54（2）：77-83.

［3］Slack JM.Stem cells in epithelial tissues ［J］.Science，2000，287（5457）：1431-1433.

［4］Akiyama M，Smith LT，Shimizu H.Changing patterns of localization of putative stem cells in developing human hair follicles［J］.JInvest Dermatol，2000，114（2）：321-327.

［5］Coolen NA，Verkerk M，Reijnen L，et al.Culture of keratinocytes for transplantation without the need of feeder layer cells［J］.Cell Transplant，2007，16（6）：649-661.

［6］Scbiirer N，Koline A，Schliep V，et al.Lipid composition and synthesis of HaCaTcells，an immortalized human，keratinocyte line，in comparisonwithnormalhumanadultkeratinocytes［J］.Exp Dermatol，1993，2（4）：179-185.

［7］Micallef L，Belaubre F，Pinon A，et al.Effects of extracellular calcium on the growth-differentiation switch in immortalized keratinocyte HaCaTcells compared with normal human keratinocytes［J］.Exp Dermatol，2009，18（2）：143-151.

［8］周洪軍，胡志奇，譚挺，等.人毛囊外根鞘隆起、真皮鞘和毛乳頭細胞高效同步分離培養(yǎng)的方法［J］.南方醫(yī)科大學學報，2008，28（2）：193-195.

（編輯 陳 姜，英文編輯 陳 姜）

Serum-free Primary Culture of Human Skin Keratinocytes

DIZheng-hong，SUNXiao-dong，WANGYa-kun，CHENHong-duo，GAOXing-hua
（Department of Dermatology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo establish a method for the primary culture in vitro of human skin keratinocytes in a serum-，bovine pituitary extract-，and feeder cell-free medium.MethodsThe keratinocytes were isolated from the foreskins of healthy young men by two-step digestion with trypsin-EDTA.The primary culture and passage of keratinocytes was established in the serum-and bovine pituitary extract-free medium.The keratinocytes were identified by morphological observation and immunohistochemistry，and the growth curve was plotted.ResultsPrimary keratinocytes with high purity and activity were obtained in 2weeks and passaged for at least 5consecutive generations.The results of immunohistochemistry showed that 99%of the cultured cells were keratinocytes.ConclusionTwo-step digestion and primary culture in vitro in a serum-and bovine pituitary extract-free medium is an ideal method to obtain enough karatinocytes for research work.

human；skin；keratinocyte；serum-free；bovine pituitary extract-free；primary culture

R322.99；Q343.6

A

0258-4646（2010）12-1037-04

教育部長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（IRT0760）；遼寧省教育廳高?？蒲杏媱濏椖浚↙2010697）

狄正鴻（1973-），女，副主任醫(yī)師，碩士.

高興華，E-mail：gaobarry@hotmail.com

2010-10-11