馬洪偉，付秀美，付文亮，和亞強(qiáng)，陳志宏，薛景鳳

（承德醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 067000）

遠(yuǎn)志對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)的保護(hù)作用

馬洪偉，付秀美，付文亮，和亞強(qiáng)，陳志宏，薛景鳳

（承德醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 067000）

目的 探討遠(yuǎn)志對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）大鼠坐骨神經(jīng)的保護(hù)作用。方法 雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組、DPN模型組、遠(yuǎn)志治療組和遠(yuǎn)志預(yù)防組，每組12只。DPN模型組、遠(yuǎn)志治療組和遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠均建立鏈脲佐菌素致糖尿?。―M）大鼠模型。待DM模型建立后，遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠給予遠(yuǎn)志（生藥2.7g·kg-1·d-1）灌胃6周；DPN模型組和遠(yuǎn)志治療組大鼠以尾部感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNCV）＜30m/s為標(biāo)準(zhǔn)建立DPN大鼠模型后，DPN組大鼠不再做任何處理，遠(yuǎn)志治療組大鼠給予同等劑量遠(yuǎn)志灌胃6周。測(cè)定各組大鼠尾部SNCV，紫外分光光度法測(cè)定坐骨神經(jīng)醛糖還原酶（AR）活性，免疫組織化學(xué)方法觀察坐骨神經(jīng)神經(jīng)絲蛋白（NFP）的表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，DPN模型組大鼠尾部SNCV明顯降低（P<0.01），坐骨神經(jīng)AR活性明顯增強(qiáng)（P<0.01）、NFP表達(dá)明顯降低（P<0.01）；與DPN模型組比較，遠(yuǎn)志治療組與遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠尾部SNCV明顯提高（P<0.01），坐骨神經(jīng)AR活性明顯減弱（P<0.01）、NFP的表達(dá)明顯升高（P<0.05）。結(jié)論 遠(yuǎn)志可通過(guò)提高大鼠尾部SNCV、降低坐骨神經(jīng)AR活性、上調(diào)坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)的保護(hù)作用；且遠(yuǎn)志預(yù)處理對(duì)DM大鼠坐骨神經(jīng)損傷具有預(yù)防作用。

遠(yuǎn)志；糖尿病周圍神經(jīng)病變；坐骨神經(jīng)

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病（diabetic mellitus，DM）最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率高達(dá)47%～91%，以四肢遠(yuǎn)端感覺(jué)異?；颍ê停┻\(yùn)動(dòng)障礙為主要臨床表現(xiàn)。DPN可累及任何神經(jīng)，且感覺(jué)神經(jīng)多先于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)受損。DPN的發(fā)病機(jī)制迄今尚未明確，臨床上缺乏確切有效的治療藥物。近年來(lái)，中藥多靶點(diǎn)治療疾病受到越來(lái)越多的關(guān)注。遠(yuǎn)志（Polygala）為遠(yuǎn)志科多年生草本植物，以干燥根入藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被視為養(yǎng)命要藥，有益智強(qiáng)志之功效。以往的研究證實(shí)中藥遠(yuǎn)志對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用［1～3］，但關(guān)于遠(yuǎn)志對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)影響的國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。本研究擬建立DPN動(dòng)物模型，通過(guò)觀察遠(yuǎn)志對(duì)DPN大鼠尾部感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（sense nerve conduction velocity，SNCV）、坐骨神經(jīng)醛糖還原酶（aldose reductase，AR）活性和神經(jīng)絲蛋白（neurofilament protein，NFP）表達(dá)的影響，深入探討遠(yuǎn)志對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑

遠(yuǎn)志水煎液由中藥遠(yuǎn)志浸泡、煎煮、過(guò)濾、濃縮而成（1g生藥/ml）；血糖檢測(cè)試劑盒由保定長(zhǎng)城臨床試劑有限公司提供，批號(hào)20090511；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）和DL-甘油醛購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；NADPH購(gòu)于瑞士Roche公司；鼠抗NFP抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；SP免疫組化試劑盒購(gòu)于北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

成年雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量（200±20）g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：905075）。隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、DPN模型組、遠(yuǎn)志治療組和遠(yuǎn)志預(yù)防組，每組12只。正常對(duì)照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理；DPN模型組、遠(yuǎn)志治療組和遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠均連續(xù)腹腔注射2%STZ（用pH4.4枸櫞酸鹽緩沖液稀釋，25mg/kg，3d），1周后以血糖（blood glucose，BG）≥16.7mol/L作為 DM成模標(biāo)準(zhǔn)。待DM模型建立后，遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠給予遠(yuǎn)志（生藥 2.7g·kg-1·d-1）灌胃 6周；DPN模型組和遠(yuǎn)志治療組大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)6周后，檢測(cè)大鼠尾部SNCV，以尾部SNCV＜30m/s為DPN大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)，待DPN模型成功建立后，DPN組大鼠不再做任何處理，遠(yuǎn)志治療組大鼠給予遠(yuǎn)志（生藥 2.7g·kg-1·d-1）灌胃6周。

1.4 檢測(cè)BG

各組大鼠用藥結(jié)束后禁食12h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血1ml于EP管中，3000r/min離心20min，收集血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)BG。

1.5 測(cè)定尾部SNCV

4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定，保持室內(nèi)溫度25℃，分別用溫水、75%乙醇清潔大鼠尾部皮膚。將一對(duì)刺激電極（負(fù)極位于正極近心側(cè)）插入大鼠尾部遠(yuǎn)端皮下，兩電極間隔0.5cm，依次將記錄電極Ⅰ和記錄電極Ⅱ插入大鼠尾部近端皮下，其中記錄電極Ⅰ在刺激電極負(fù)極近心側(cè)3cm處，記錄電極Ⅱ在記錄電極Ⅰ近心側(cè)4cm處，再將參考電極Ⅰ、Ⅱ分別插入距記錄電極Ⅰ、Ⅱ近心側(cè)0.5cm處皮下，最后將接地電極插入刺激電極負(fù)極與記錄電極Ⅰ之間。采用RM6240C型多道生理信號(hào)處理系統(tǒng)測(cè)定各組大鼠尾部SNCV，重復(fù)給予刺激3次，每次間隔30s，取平均值。尾部SNCV（m/s）=兩記錄電極之間的距離/動(dòng)作電位潛伏期時(shí)間差。

1.6 測(cè)定坐骨神經(jīng)AR活性

大鼠取血后斷頭處死，迅速分離并取出雙側(cè)坐骨神經(jīng)（在膝關(guān)節(jié)上方取長(zhǎng)約4cm的坐骨神經(jīng)干），一側(cè)入Bouins液固定，一側(cè)入液氮保存。

取坐骨神經(jīng)，用預(yù)冷的 PBS（0.01mmol/L，pH7.2～7.4）沖洗后，按1∶4加入預(yù)冷的PBS制成組織勻漿，4℃、12000r/min離心40min，上清即為酶粗提取液，以BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。AR活性測(cè)定以DL-甘油醛為底物，反應(yīng)體系為0.1mol/L磷酸緩沖液 ［內(nèi)含 0.4mol/L（NH4）2SO4，pH6.2］，0.08mmol/LNADPH，5mmol/LDL-甘油醛，5μl酶粗提取液，使反應(yīng)體積為100μl。反應(yīng)自加入底物開(kāi)始，37℃水浴反應(yīng)5min，加入預(yù)冷的0.1mol/L磷酸緩沖液100μl終止反應(yīng)，采用DU800紫外分光光度計(jì)測(cè)定NADPH在340nm吸光值。1個(gè)單位（U）AR活性定義為1min內(nèi)1μmol NADPH被氧化的酶量，AR活性用U/mgprot表示。

1.7 檢測(cè)坐骨神經(jīng)NFP表達(dá)及數(shù)據(jù)處理

取Bouins液固定的坐骨神經(jīng)，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm。SP免疫組織化學(xué)染色法觀察坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá)。鼠抗NFP一抗稀釋濃度為1∶50，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。以坐骨神經(jīng)軸索中出現(xiàn)棕黃色顆粒為NFP陽(yáng)性產(chǎn)物。

采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在10×20倍顯微鏡下對(duì)免疫組化陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行定量分析，每組隨機(jī)選取6個(gè)大鼠坐骨神經(jīng)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本選取3張切片，以免疫陽(yáng)性產(chǎn)物面積占視野面積的比值作為NFP的相對(duì)表達(dá)水平，取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠BG的變化

DPN模型組大鼠BG明顯高于正常組（P＜0.01）；遠(yuǎn)志治療組和遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠BG明顯低于DPN模型組（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 大鼠尾部SNCV的變化

與正常組大鼠比較，DPN模型組大鼠尾部SNCV明顯降低（P＜0.01）。遠(yuǎn)志治療組和遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠尾部SNCV明顯高于DPN模型組（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.3 大鼠坐骨神經(jīng)AR活性的變化

DPN模型組大鼠坐骨神經(jīng)AR活性明顯高于正常組大鼠（P＜0.01），遠(yuǎn)志治療組和遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠坐骨神經(jīng)AR活性明顯低于DPN模型組（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠BG和SNCV（±s）Tab.1 BGand SNCVof the rats in each group（x ±s）

表1 各組大鼠BG和SNCV（±s）Tab.1 BGand SNCVof the rats in each group（x ±s）

1）Vs normal control group，P ＜ 0.01；2）Vs DPNmodel group，P ＜ 0.01.

Group n BG（mmol/L） SNCV（m/s）Normal control group 12 7.53±1.31 36.57±2.08DPNmodel group 12 25.40±4.221） 27.45±1.161）Polygala treatment group 12 17.20±4.562） 33.20±1.092）Polygala prevent group 12 15.80±5.602） 33.01±1.982）

表2 大鼠坐骨神經(jīng)AR活性和NFP表達(dá)（±s）Tab.2 ARactivity and NFPexpression on sciatic nerve of rats（x ±s）

表2 大鼠坐骨神經(jīng)AR活性和NFP表達(dá)（±s）Tab.2 ARactivity and NFPexpression on sciatic nerve of rats（x ±s）

1）Vs normal control group，P ＜ 0.01；2）Vs DPNmodel group，P ＜ 0.01；3）Vs DPNmodel group，P ＜ 0.05.

Group n ARactivity（U/mgprot） NFPexpression Normal control group 12 0.2645±0.1913 0.3023±0.0309DPNmodel group 12 1.0695± 0.18111） 0.1872±0.02971）Polygala treatment group 12 0.6266± 0.16332） 0.2464±0.04523）Polygala prevent group 12 0.3475± 0.10682） 0.2597±0.02163）

2.4 大鼠坐骨神經(jīng)NFP表達(dá)的變化

NFP陽(yáng)性產(chǎn)物為棕褐色顆粒，位于坐骨神經(jīng)軸索（圖1）。與正常對(duì)照組大鼠比較，DPN模型組大鼠坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá)明顯降低（P＜0.01），遠(yuǎn)志治療組和遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá)明顯高于DPN模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 大鼠坐骨神經(jīng)NFP表達(dá)×400Fig.1 NFPexpression on sciatic nerve of rats by immunohistochemistry×400

3 討論

3.1 遠(yuǎn)志對(duì)DPN大鼠尾部SNCV的影響

長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)?？蓪?dǎo)致各種臟器，尤其是眼、腎、神經(jīng)及心血管的慢性損害、功能不全和衰竭。DPN發(fā)病隱匿，主要臨床表現(xiàn)為四肢遠(yuǎn)端（尤其是下肢）對(duì)稱性感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)障礙，已成為糖尿病致殘、致死的主要原因之一。DPN可累及感覺(jué)神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和自主神經(jīng)，但以感覺(jué)神經(jīng)最為常見(jiàn)［4］。在臨床癥狀出現(xiàn)前，電生理檢查就可發(fā)現(xiàn)神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，特別是SNCV測(cè)定，可提示亞臨床期的周圍神經(jīng)病變，是早期診斷DPN的敏感指標(biāo)［5］。研究表明，DPN時(shí)周圍神經(jīng)軸索萎縮，可引起周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，DPN大鼠尾部SNCV明顯降低，遠(yuǎn)志治療組和遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠尾部SNCV明顯高于DPN大鼠；表明遠(yuǎn)志治療可明顯加快DPN大鼠尾部SNCV，遠(yuǎn)志預(yù)處理可有效阻止DM大鼠尾部SNCV的減慢。

3.2 遠(yuǎn)志對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)AR活性的影響

DPN的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，但已知并非單一因素所致。一般認(rèn)為高血糖導(dǎo)致代謝異常是DPN發(fā)病的潛在啟動(dòng)與關(guān)鍵因素之一。多元醇代謝通路有兩個(gè)關(guān)鍵酶，即AR和山梨醇脫氫酶，AR可催化葡萄糖轉(zhuǎn)化成山梨醇，山梨醇脫氫酶催化山梨醇轉(zhuǎn)化為果糖。DM時(shí)，長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)可使葡萄糖多元醇代謝通路紊亂，導(dǎo)致AR活性增強(qiáng)，致使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)山梨醇、果糖大量積聚，繼而引起神經(jīng)細(xì)胞滲透壓增高，Na+-K+-ATP酶活性下降，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、變性，生理功能受損，軸索萎縮，神經(jīng)纖維節(jié)段性脫髓鞘［7］。另外，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)果糖的積聚可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白的糖化，干擾軸索的軸漿運(yùn)輸，引起神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的改變［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，DPN模型組大鼠坐骨神經(jīng)AR活性明顯增強(qiáng)，遠(yuǎn)志治療組和遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠坐骨神經(jīng)AR活性顯著低于DPN大鼠，表明遠(yuǎn)志治療可明顯降低DPN大鼠坐骨神經(jīng)AR活性，遠(yuǎn)志預(yù)處理可明顯阻止DM大鼠坐骨神經(jīng)AR活性的升高。

3.3 遠(yuǎn)志對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)NFP表達(dá)的影響

細(xì)胞骨架（cytoskeleton）是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的非膜性細(xì)胞器，由微管、中間絲和微絲等組成。NFP為神經(jīng)元中間絲的主要成分，除形成細(xì)胞骨架起支持作用，還與微管、微絲一起參與細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸。DM時(shí)NFP的表達(dá)可下降26%～46%，并伴有神經(jīng)纖維中NFP數(shù)量減少和密度降低［9］。NFP表達(dá)的減少可導(dǎo)致神經(jīng)元的合成、遷移和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程出現(xiàn)障礙，因此無(wú)法維持神經(jīng)系統(tǒng)正常的功能活動(dòng)［10］。Zochodne等［11］研究表明，NFP可以延緩DM時(shí)高血糖對(duì)小鼠坐骨神經(jīng)軸索的損害。本研究發(fā)現(xiàn)，DPN模型組大鼠坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá)明顯下降，遠(yuǎn)志治療組和遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá)高于DPN大鼠，表明遠(yuǎn)志治療可明顯升高DPN大鼠坐骨神經(jīng)NFP的表達(dá)，遠(yuǎn)志預(yù)處理可明顯阻止DM大鼠坐骨神經(jīng)NFP表達(dá)的下降。

綜上所述，遠(yuǎn)志顯著改善DPN大鼠尾部SNCV，并通過(guò)降低坐骨神經(jīng)AR活性，上調(diào)坐骨神經(jīng)NFP表達(dá)，對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)具有良好的保護(hù)作用；遠(yuǎn)志預(yù)處理可顯著延緩DM時(shí)大鼠坐骨神經(jīng)損傷。但相關(guān)作用機(jī)制不十分明確，尚有待進(jìn)一步研究。

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（編輯 武玉欣，英文編輯 趙傳勝）

Protective Effects of Polygala on Sciatic Nerve of Diabetic Peripheral Neuropathy Rats

MAHong-wei，F(xiàn)UXiu-mei，F(xiàn)UWen-liang，HEYa-qiang，CHENZhi-hong，XUEJing-feng
（Department of Human Anatomy，Chengde Medical College，Hebei Chengde 067000，China）

ObjectiveTo investigate the protective effects of Polygala on sciatic nerve of diabetic peripheral neuropathy（DPN）rats.MethodsMale Wistar rats were randomly divided into 4groups（n=12）：normal control group，DPNmodel group，Polygala treatment group and Polygala prevention group.The rats in DPNmodel group，Polygala treatment group and Polygala prevention group were made diabetes model by injecting streptozocin intraperitoneally.After the diabetes model was established，the rats in Polygala prevention group were lavaged with Polygala（2.7g·kg-1·d-1）for six weeks.The rats in DPNmodel group and Polygala treatment group were made DPNmodel when their caudal sense nerve conduction velocity （SNCV）was less than 30m/s；then the rats in Polygala treatment group were lavaged with Polygala（2.7g·kg-1·d-1）for six weeks.The caudal SNCVof rats in each group were respectively detected；Aldose reductase （AR）activity was detected by ultraviolet spectrophotometry and immunohistochemical staining was used to observe the expression of neurofilament protein（NFP）in sciatic nerve.ResultsCompared with normal rats，the caudal SNCVof DPNmodel rats decreased obviously，ARactivity of sciatic nerve increased markedly and NFPexpression decreased obviously （P<0.01）.Compared with DPNmodel rats，the caudal SNCVof rats in Polygala treatment group and Polygala prevention group obviously increased，ARactivity of sciatic nerve decreased markedly and NFPexpression obviously （P<0.01，P<0.05）increased.ConclusionPolygala has protective effects on DPNrats sciatic nerve by improving caudal SNCV，decreasing ARactivity and up regulating NFPexpression in sciatic nerve；moreover，Polygala pretreatment has preventive effects on sciatic nerve injury of diabetes rats.

Polygala；diabetic peripheral neuropathy；sciatic nerve

R961

A

0258-4646（2010）12-1001-04

河北省教育廳基金資助項(xiàng)目（2008407,2009404）

馬洪偉（1983-），男，助教，碩士.

薛景鳳，E-mail：xjf@cdmc.edu.cn

2010-08-23