賈永蕊

流式細(xì)胞術(shù)，即利用流式細(xì)胞計(jì)對(duì)處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單細(xì)胞活生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同時(shí)對(duì)特定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)，是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、半導(dǎo)體技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)等各學(xué)科的知識(shí)，它是一種自動(dòng)分析的技術(shù)。隨著流式細(xì)胞術(shù)的不斷發(fā)展和完善，應(yīng)用領(lǐng)域也從細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究擴(kuò)大到腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、藥物學(xué)、臨床檢驗(yàn)等各方面[1]。

目前，DNA分析在臨床和基礎(chǔ)研究的各個(gè)學(xué)科中應(yīng)用非常廣泛，通過(guò)核酸染料標(biāo)記DNA，并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的分布狀態(tài)，計(jì)算出G0/G1%，S%及G2/M/%，了解細(xì)胞的增殖能力，還可以通過(guò)DNA的倍體分析，判斷腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，給臨床的診斷和療效判斷提供重要的佐證[2]。另外，細(xì)胞凋亡晚期標(biāo)志性的事件是染色體DNA斷裂，產(chǎn)生的DNA片段在流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)得到相應(yīng)的亞二倍體峰（Sub G1峰）。

1 流式細(xì)胞儀工作原理

1.1 流式細(xì)胞儀的主要結(jié)構(gòu)

流式細(xì)胞儀主要包括三大部分：（1）流動(dòng)室和液流系統(tǒng)(Fluidics system) ;（2）光學(xué)系統(tǒng)(Optics system); （3）電子系統(tǒng)(electronics system)。如圖1－1所示。

1.2 流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào)

當(dāng)液流中的細(xì)胞或顆粒通過(guò)測(cè)量區(qū)，經(jīng)激光照射后，當(dāng)液流中的細(xì)胞在激光照射激發(fā)下，就會(huì)向各方向發(fā)射散射光和熒光（見(jiàn)圖1-2），通過(guò)放在各方向上的光敏元件，就可得到每個(gè)細(xì)胞的一組相關(guān)參數(shù)[3]。

圖1 －1 流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)示意圖

圖1-2 細(xì)胞經(jīng)激光激發(fā)后產(chǎn)生的散射光和熒光

散射光信號(hào)分為前向角散射光（Forward Scatter, FSC）和側(cè)向散射光（Side Scatter，SSC），散射光不依賴(lài)任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)（如染色），因此被稱(chēng)為細(xì)胞的物理參數(shù)，即反映細(xì)胞的大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

激光束與細(xì)胞正相交時(shí)，產(chǎn)生兩種熒光信號(hào)，一種是細(xì)胞自發(fā)熒光，另一種熒光信號(hào)是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色的特異性熒光。染料受激光照射后發(fā)射的。某些物質(zhì)在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長(zhǎng)比照射光波長(zhǎng)長(zhǎng)的光線——即熒光。特異性熒光探針與單克隆抗體相結(jié)合后，與細(xì)胞膜或胞內(nèi)的靶抗原相結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)熒光素的信號(hào)強(qiáng)弱就可以了解抗原表達(dá)量的多少（見(jiàn)圖1-3）。

圖1 -3

2 流式細(xì)胞術(shù)在DNA分析中的應(yīng)用

2.1 檢測(cè)細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)最初的應(yīng)用之一便是檢測(cè)細(xì)胞的DNA含量，它可快速將細(xì)胞循環(huán)中的其它階段與有絲分裂期區(qū)別開(kāi)來(lái)。通過(guò)DNA的分析可以了解細(xì)胞群體中各個(gè)周期的比率，可以知道目的細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖狀態(tài)。細(xì)胞由DNA含量增加至分裂，再由它的子代繼續(xù)復(fù)制并分裂，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)之為細(xì)胞周期。在細(xì)胞周期中最具特征性的階段是在分裂前的DNA含量增加并達(dá)到2倍量的時(shí)候，并在此時(shí)細(xì)胞開(kāi)始分裂其自身-有絲分裂期。細(xì)胞周期中這兩個(gè)循環(huán)步驟通常以一字母來(lái)表示：S期（合成期）和M期（有絲分裂期）。有絲分裂完成后和DNA合成剛開(kāi)始之時(shí)有短暫的停頓或間隙，同樣的停頓或間隙存在于DNA合成期后和有絲分裂開(kāi)始之時(shí)。這兩個(gè)間隙我們將之命名為G1和G2期。這樣整個(gè)細(xì)胞周期可劃分為G1 → S → G2 →M → G1，如圖（2-1）所示：

圖2-1 細(xì)胞周期在流式細(xì)胞儀上分析時(shí)的圖譜特征

下面是研究Hela細(xì)胞在40μg/ml蒙古黃芪凝集素作用24 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，從而可以了解藥物的抗癌效果和作用機(jī)理[4]。

圖2-3 蒙古黃芪凝集素對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響

2.2 分析DNA倍體

DNA分析還可以了解細(xì)胞群體的倍體，某些惡性腫瘤細(xì)胞中會(huì)含有異倍體、多倍體、亞二倍體細(xì)胞，通過(guò)倍體分析也可以為腫瘤診斷提供一個(gè)佐證。DNA倍體的判定是根據(jù)DNA指數(shù)（DNA Index,DI）確定的，即所測(cè)細(xì)胞群的G0/G1期DNA含量與正常二倍體標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞G0/G1期DNA含量的比值。以正常二倍體細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞的DNA含量定為2C值DI＝1，因?yàn)閮x器本身和樣本制備過(guò)程中存在的種種誤差，一般認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)二倍體細(xì)胞的CV應(yīng)該在5%以下，DNA含量在2C±2CV范圍內(nèi)，認(rèn)為是二倍體[5]。

（1）DI＝1.0±0.01 （0.90～1.10）為二倍體

（2）DI＝1.0±0.15（0.85～1.15）為近二倍體

（3）DI＝2.0±0.1（1.90～2.10）為四倍體

（4）DI＞2.10 為多倍體

這些檢測(cè)是基于對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA以化學(xué)定量方式的染色（染料著色數(shù)量直接與細(xì)胞內(nèi)DNA含量相關(guān)）。

正常細(xì)胞具有較恒定的DNA含量，而細(xì)胞癌變過(guò)程中結(jié)構(gòu)和/或染色體的異常是很常見(jiàn)的。這種變化在流式分析中以DNA倍體指數(shù)的形式表現(xiàn)出來(lái)，這一指數(shù)對(duì)于腫瘤的早期診斷，交界瘤、間葉組織腫瘤的良惡性判斷提供了重要的輔助指標(biāo)。

應(yīng)該注意的是，只有在染色體數(shù)目的變化帶來(lái)的DNA含量差異可被檢測(cè)時(shí)，才可能有DNA異倍體的檢出。因此DNA含量的正常不能除外惡性或染色體異常的存在。另外，正常細(xì)胞在衰老過(guò)程中的多倍體化以及腫瘤治療后導(dǎo)致的DNA含量的增加、凋亡和壞死導(dǎo)致的DNA含量降低都是在分析DNA直方圖時(shí)需要考慮的因素。

圖2-4 結(jié)腸癌患者組織DNA四倍體細(xì)胞的直方圖，DI為2.03

2.3 檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖2-5 VP16治療后IM9細(xì)胞的凋亡

細(xì)胞凋亡的后期事件之一是染色體DNA的斷裂，即是在核小體的位置進(jìn)行切割，故而在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)成200 bp及200整數(shù)倍長(zhǎng)度的DNA片斷，這些斷裂的DNA片段會(huì)滲透到細(xì)胞膜外，用PI標(biāo)記DNA，通過(guò)流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)到亞二倍體峰（Sub G1峰），主要就是由上述的DNA產(chǎn)生的，從而可以了解凋亡細(xì)胞的含量。

20 mM的VP16作用于IM9細(xì)胞，碘化丙啶（PI）染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)，IM9細(xì)胞的凋亡情況。與0 h（未處理的細(xì)胞）相比，VP16作用12 h和24 h后沒(méi)有明顯的凋亡，作用36 h凋亡率為11.23%。

[1]宋平根. 流式細(xì)胞術(shù)的原理與應(yīng)用[M].北京：北京師范大學(xué)出版社，1992:7.

[2]王建中. 臨床流式細(xì)胞分析[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2005:459.

[3]吳后男. 流式細(xì)胞術(shù)原理與應(yīng)用教程[M]. 北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2008:17.

[4]Qiaojuan Yan，Yanxia Li，Zhengqiang Jiang，etc. Antiproliferation and apoptosis of human tumor cell lines by a lectin (AMML) of Astragalus mongholicus[J]. Phytomedicine. 2009,16: 586-593.

[5]王書(shū)奎. 實(shí)用流式細(xì)胞術(shù)彩色圖譜[M]. 上海： 第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2004:121.