李小芳， 熊婷婷， 王 嬌， 曹小勇， 李 珂， 邊琳晶

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都611137)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種原因不明的慢性結(jié)腸炎，其病程長、反復(fù)發(fā)作、難治愈，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。流行病學(xué)資料提示，UC的發(fā)病率不論在我國和國外都有逐年增高的趨勢［1，2］。中醫(yī)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療歷史悠久，本病與中醫(yī)學(xué)的“大瘕泄”、“腸癖”、“痢疾”、“滯下”或“泄瀉”諸證類似，濕是本病的主要病理因素，脾虛濕盛是其發(fā)病關(guān)鍵，脾虛夾濕熱是本病的基本表現(xiàn)。人民衛(wèi)生出版社2000年出版的《消化科專病中醫(yī)臨床診治》將潰瘍性結(jié)腸炎分為濕熱蘊(yùn)結(jié)、肝脾不調(diào)、脾胃虛弱、脾腎陽虛、氣滯血瘀、陰血虧虛等型。《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》(2002年中國醫(yī)藥科技出版社)把潰瘍性結(jié)腸炎的中醫(yī)證型分為濕熱內(nèi)蘊(yùn)、脾胃虛弱、脾腎兩虛、陰血虧虛、氣滯血瘀等型。說明濕熱蘊(yùn)結(jié)和脾胃虛弱是潰瘍性結(jié)腸炎等胃腸病的常見證型，應(yīng)以清熱燥濕、益氣健脾方劑治療。

《得配本草》是研究中藥藥對(duì)極具價(jià)值的重要參考書，該書中記載:“黃芪得棗仁，止自汗。配干姜，暖三焦。配川連，治腸風(fēng)下血。配茯苓，治氣虛白濁……”書中明確指出“黃芪配川連，治腸風(fēng)下血”，可知在古代中醫(yī)藥實(shí)踐中，將黃芪配伍黃連使用，臨床可用于治療“腸癖”、“滯下”、“便血”等?！夺t(yī)宗金鑒·外科心法要訣》卷六十三方記載的“黃連消毒飲”，方中將黃連、黃芪作為君臣藥，用于治癰疽瘡瘍，紅腫熱痛等癥。

在中醫(yī)藥對(duì)UC的臨床治療中，根據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)［3］，我們可以得出，各類藥用藥頻率百分?jǐn)?shù)為:清熱藥20.65% ＞健脾(益氣)藥18.27% ＞理血藥16.93%＞斂澀藥16.20%＞行氣藥10.53%＞祛濕藥7.41%＞溫寒藥3.50%＞柔肝藥2.61% ＞化積藥2.32%＞補(bǔ)腎藥1.58%。無論是口服還是局部給藥方式，其健脾益氣藥和清熱藥出現(xiàn)的頻率都很高，在UC的臨床治療中發(fā)揮著舉足輕重的作用。因此，根據(jù)臨床實(shí)際用藥情況和處方精練的角度出發(fā)，選擇健脾益氣藥和清熱燥濕藥的常用代表性藥物黃芪和黃連組成腸康舒處方用于UC的臨床治療。

黃芪和黃連現(xiàn)代化學(xué)研究結(jié)果表明，黃芪中含皂苷、多糖、香豆素、黃酮等多種化學(xué)成分，其中黃芪皂苷含量約為0.26% ～0.88%，黃芪多糖達(dá)4% ～6%［4］;黃連根莖中含多種異喹啉類生物堿，以小檗堿含量最高，為5% ～8%［5］。黃芪皂苷具有抑制組胺引起的腦血管通透性增加、能清除自由基、抗生物氧化、雙向免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用。黃芪多糖具有雙向免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)菌活性、抗病毒、改善局部血液微循環(huán)、降低炎癥反應(yīng)等作用［6］;黃連具有抗菌、抗腹瀉、保護(hù)損傷黏膜、抑制潰瘍、抗炎、抗腫瘤等作用［5］。

從以上分析可見，黃芪中皂苷、多糖，黃連總堿等成分所具有的藥理作用，與目前西醫(yī)認(rèn)為UC是感染、免疫、遺傳等多種因素綜合作用所致，主要采用抗炎、抗菌和抑制免疫反應(yīng)等方法相吻合，可能為黃芪、黃連起效的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，擬以黃芪皂苷、黃芪多糖、黃連總堿組合成新復(fù)方腸康舒。

為明確擬定處方的療效，并進(jìn)一步篩選出處方的最佳組合方式，最終確定以有效組分組成的腸康舒方，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 藥物及試劑

黃芪、黃連飲片(購買自成都五塊石中藥材市場);黃連總堿提取物(陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號(hào):HLZJ080723，黃連總堿含量為98.86%)，黃芪皂苷提取物(陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號(hào):HQT071017450，黃芪皂苷含量為52.14%)，黃芪多糖提取物(陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號(hào):HQT071117550，黃芪多糖含量為71.34%);柳氮磺胺吡啶(SASP，上海三維制藥有限公司，批號(hào):200802C08)，2，4，6- 三硝基苯磺酸(TNBS，Sigma公司，批號(hào):107K5008)，甲醛(成都科龍?jiān)噭┯邢薰?。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，♀♂各半，體重200～250 g;四川省中藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 儀器

高效液相色譜儀(日本島津)，顯微電鏡(BX51，OLYMPUS)，切片機(jī)(HM335E，MICROM)，石蠟包埋機(jī)(EG1160，LEICA)。

1.4 大鼠UC模型制備

1.4.1 造模試劑的配制 5%三硝基苯磺酸(TNBS)與無水乙醇以體積1∶1配成25 mg(TNBS)/mL(混合液)，備用。

1.4.2 造模 健康200～250 g SD大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，乙醚麻醉，用大號(hào)灌胃針頭(16號(hào))涂抹少許凡士林直接插入大鼠體內(nèi)，灌胃針頭頭部光滑不會(huì)刺傷大鼠結(jié)腸。用2 mL注射器緩慢注入相應(yīng)體重比例的造模劑(80 mg/kg)，然后再注入一段長約0.3 mL的空氣，盡可能清除黏附在注射器與灌腸管壁上的藥液;造模后，倒提大鼠尾部30 s，然后大鼠仰臥歸籠，自然清醒，自由飲食，每天觀察精神、皮毛、大便、活動(dòng)、飲食、存活等情況。

1.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)

計(jì)算腸重系數(shù)及病理學(xué)檢查:于造模完成后1周處死大鼠，取結(jié)腸8 cm，沿縱軸剪開，冰生理鹽水反復(fù)沖洗，吸干水分，稱重，用10% 甲醛固定，石蠟包埋，切片(4 μm)，常規(guī) HE染色。光鏡下觀察。腸重系數(shù)(%)=結(jié)腸重/大鼠體重×100%;組織學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:潰瘍:分三級(jí)，0-無，1-小潰瘍(小于 3 mm)，2-大潰瘍(大于 3mm);炎癥:0-無，1-輕度，2-重度;肉芽組織:0-無，1-有;病變深度:0-無，1-黏膜下層，2-肌層，3-漿膜層;纖維化:0-無，1-輕，2-重。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

貴州若想大力發(fā)展自身農(nóng)機(jī)技術(shù)，就必須做到因勢利導(dǎo)、因地制宜，根據(jù)不同區(qū)域的自然稟賦作出分類指導(dǎo)發(fā)展決策，創(chuàng)造新的耕作制度與經(jīng)濟(jì)條件，堅(jiān)持走技術(shù)化路線，用創(chuàng)新技術(shù)彌補(bǔ)地緣缺陷，率先鼓勵(lì)某些有條件的區(qū)域大力發(fā)展農(nóng)機(jī)化，盡可能提升省內(nèi)農(nóng)機(jī)化平均水平。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 處方的藥效學(xué)試驗(yàn)

2.1.1 分組及給藥 健康SD大鼠48只，♀♂各半，隨機(jī)分成6組，每組8只，依次為正常組、模型組、陽性對(duì)照組、腸康舒煎液高、中、低劑量組。灌腸給予對(duì)應(yīng)藥物3 d，正常組、模型組給予相同體積的生理鹽水，第3天給藥后，除正常組外，其余組按1.4.2項(xiàng)下方法造模。造模的第2天起，正常組和模型組灌腸給予同體積生理鹽水，普通飼養(yǎng);其余組灌腸給藥，每日1次，連續(xù)7 d，各組大鼠灌腸量為0.5 mL/100 g。給藥劑量見表1。

表1 各組給藥劑量

2.1.2 結(jié)果 見表2

表2 腸康舒水煎液對(duì)大鼠UC模型的影響結(jié)果(±s，n=8)

表2 腸康舒水煎液對(duì)大鼠UC模型的影響結(jié)果(±s，n=8)

注:與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

正常組 8 同體積生理鹽水 0.312 5±0.036 1** 0±0組別 動(dòng)物數(shù)/只劑量/(g生藥/kg大鼠)腸重系數(shù)/%組織學(xué)損傷評(píng)分**模型組 8 同體積生理鹽水 0.717 1±0.077 6 5.86±3.08陽性組 8 0.3 g/kg SASP 0.548 6±0.085 4* 3.38±2.26*高劑量組 8 黃芪4 g黃連4 g 0.595 7±0.135 1 4.0±1.41中劑量組 8 黃芪2 g黃連2 g 0.553 8±0.084 0* 3.25±2.12*低劑量組 8 黃芪1 g黃連1 g 0.493 7±0.075 9**2.25±1.91**

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組腸重系數(shù)、結(jié)腸潰瘍面積、炎癥程度、病變深度和纖維化程度等指標(biāo)均存在顯著性差異(P＜0.01)，表明該模型模擬成功。腸康舒水煎液中劑量組、低劑量組、陽性對(duì)照組與模型組比較，均能顯著減小腸重系數(shù)、結(jié)腸潰瘍面積，減輕病變深度、炎癥和纖維化程度。這表明，腸康舒方中、低劑量組對(duì)UC大鼠均具有良好的治療作用，其中低劑量組各指標(biāo)有顯著性差異，因此擬以低劑量作為處方量(即黃芪6 g，黃連6 g)。

2.2 處方拆方及最優(yōu)組合篩選實(shí)驗(yàn)

在2.1項(xiàng)實(shí)驗(yàn)確定的處方量的基礎(chǔ)上，取健康SD大鼠64只，♀♂各半，隨機(jī)分成8組，每組8只，依次為正常組、模型組、陽性對(duì)照組、黃芪組、黃連組、黃芪-黃連3 ∶1組、1 ∶1組、1 ∶3組。按1.4.2項(xiàng)下造模、給藥，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)相關(guān)指標(biāo)，考察不同處方對(duì)結(jié)腸病變的治療效果，結(jié)果見表3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芪連1∶1組、芪連3∶1組與模型組比較，均能顯著減輕腸重系數(shù)、炎癥程度，縮小潰瘍面積，降低病變深度和纖維化程度。陽性組、黃連組可減輕腸重系數(shù)，有縮小潰瘍面積、降低病變深度和纖維化程度，并有減輕炎癥的趨勢。綜合以上各指標(biāo)的比較結(jié)果可見，單用黃芪或黃連的療效不及兩者合用;在兩者的不同比例組中以1∶1和3∶1兩組療效最佳，明顯優(yōu)于1∶3組。而1∶1組的整體治療效果又略優(yōu)于3∶1組。因此，綜合考慮選擇黃芪-黃連1∶1為的最佳處方。即優(yōu)選的處方為黃芪6 g、黃連6 g。

表3 腸康舒水煎液不同配比對(duì)大鼠UC模型的影響(±s，n=8)

表3 腸康舒水煎液不同配比對(duì)大鼠UC模型的影響(±s，n=8)

注:與模型組比較，＊P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)/只劑量/(g生藥/kg大鼠)腸重系數(shù)/%組織學(xué)損傷評(píng)分正常組 8 同體積生理鹽水 0.315±0.05** 0.286±0.756**模型組 8 同體積生理鹽水 0.653±0.081 7.125±1.727陽性組 8 0.3 g/kg SASP 0.495±0.079* 4.125±2.696*黃芪組 8 2 0.593±0.153 5.750±2.659黃連組 8 2 0.488±0.09* 4.125±2.588*芪連1:1組 8 黃芪1黃連1 0.479±0.049**2.75±2.605**芪連1:3組 8黃芪0.5黃連1.5 0.508±0.130 5.125±4.291芪連3:1組 8黃芪1.5黃連0.5 0.418±0.101**3.5±3.024*

2.3 有效組分及藥材組方的藥效學(xué)對(duì)比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過文獻(xiàn)的查閱，黃芪中黃芪皂苷與多糖類成分，黃連中小檗堿具有多途徑的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，可能為腸康舒方起效的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，為了減少服用量，便于制劑成型，使成品質(zhì)量穩(wěn)定可控，擬以有效組分為原料進(jìn)行組方。

擬采用兩種UC模型對(duì)以有效組分和藥材為原料的兩處方的藥效進(jìn)行對(duì)比研究，以進(jìn)一步驗(yàn)證原處方的藥效，明確有效組分組方的藥效，并對(duì)比以藥材有效組分和藥材水煎液組合的兩處方的療效差異，在此基礎(chǔ)上確定以有效組分組方的合理性。

2.3.1 處方中有效組分劑量的選擇依據(jù) 由于藥材中有效組分含量受藥材品種、產(chǎn)地、采收、加工等多方面因素的影響而差異很大。為在同等量有效物質(zhì)的前提下，對(duì)比兩處方的療效差異。分別采用紫外分光光度法和高效液相法對(duì)本次實(shí)驗(yàn)用同批黃芪水煎液中黃芪皂苷、多糖的含量以及黃連水煎液中小檗堿含量進(jìn)行了測定［7-9］，以此含量為標(biāo)準(zhǔn)來確定處方中有效組分量，測定結(jié)果見表4、表5。

表4 黃芪水煎液中黃芪皂苷、多糖的含量測定結(jié)果

表5 黃連水煎液中小檗堿的含量測定結(jié)果

2.3.2 腸康舒方抗三硝基苯磺酸損傷的實(shí)驗(yàn)研究

健康SD大鼠40只，♀♂各半，隨機(jī)分成5組，每組8只，依次為正常組、陽性組、模型組、腸康舒水煎液組、腸康舒有效組分組。按1.4.2項(xiàng)下方法給藥、造模，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，統(tǒng)計(jì)相關(guān)指標(biāo)，綜合考察各不同處方對(duì)結(jié)腸病變的治療效果，結(jié)果見表6。

表6 腸康舒對(duì)三硝基苯磺酸損傷大鼠的影響(±s，n=8)

表6 腸康舒對(duì)三硝基苯磺酸損傷大鼠的影響(±s，n=8)

組別 動(dòng)物數(shù)/只劑量/(g生藥/kg大鼠)腸重系數(shù)/%組織學(xué)損傷評(píng)分正常組 8 同體積生理鹽水 0.323±0.045** 0±0**陽性組 8 0.3 g/kg SASP 0.503±0.068**3.375±2.615**模型組 8 同體積生理鹽水 0.619±0.101 6.625±1.061水煎液組 8 黃芪1黃連1 0.501±0.071**3.429±3.457*有效組分組 8多糖23.8 mg皂苷2.03 mg小檗堿50.4 mg 0.49±0.087**1.286±1.704**

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:水煎液組、有效組分組、陽性組與模型組比較，均能顯著減輕腸重系數(shù)、炎癥程度，縮小潰瘍面積，降低病變深度和纖維化程度。有效組分組與水煎液組比較，各項(xiàng)指標(biāo)無明顯差異，這表明有效組分組與水煎液組對(duì)三硝基苯磺酸造成的大鼠結(jié)腸病理變化的治療效果無明顯差異。

3 討論

3.1 在腸康舒的組方中，僅選擇了補(bǔ)氣藥和清熱燥濕藥的代表藥味組成處方，未將具有清熱解毒、活血止血、行氣止痛等作用的藥味選入。故擬將其臨床應(yīng)用定位為UC輕、中型發(fā)作，僅出現(xiàn)腹瀉、腹痛等炎性反應(yīng)或上述癥狀伴輕微便血者，用于UC各型發(fā)作間歇期的維持治療，以防止UC的復(fù)發(fā)。

3.2 針對(duì)目前中醫(yī)治療UC一般以臨床隨證組方為主，其療效受醫(yī)者水平的影響較大及煎劑的飲片受產(chǎn)地、采收、加工、貯存多種因素影響等問題，筆者在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，結(jié)合臨床治療經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)UC的病因病機(jī)，吸收化學(xué)、藥理研究成果，以藥效實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)方起效的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了篩選驗(yàn)證，簡化了處方，減少了服用量，利于中藥現(xiàn)代制劑的開發(fā)。

3.3 在后續(xù)研究中，將綜合設(shè)計(jì)UC相關(guān)藥理藥效實(shí)驗(yàn)，采用多種動(dòng)物模型，根據(jù)UC發(fā)病特點(diǎn)，增加相應(yīng)考察指標(biāo)，從更高水平(如分子、細(xì)胞水平)等對(duì)處方組成及藥效進(jìn)行更為系統(tǒng)的研究，以充分證明腸康舒組方的科學(xué)性，療效的可靠性。同時(shí)，進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)和長期毒性試驗(yàn)，對(duì)藥物的安全性進(jìn)行全面的評(píng)價(jià)。

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