何繼鋒， 錢(qián) 剛， 羅素元， 吳明松

(遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，貴州遵義563000)

復(fù)方瑞康欣(Compound Ruikangxin，CR)膠囊是臨床上用于治療阿片類(lèi)藥物成癮者戒斷癥狀的一組中藥復(fù)方制劑，尤其對(duì)稽延性戒斷癥狀治療效果肯定［1］，同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能明顯抑制大鼠嗎啡戒斷后的焦慮行為［2］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)CR對(duì)嗎啡戒斷焦慮大鼠治療后海馬、杏仁核和伏核神經(jīng)細(xì)胞CaMK II的含量和磷酸化水平，為臨床應(yīng)用于嗎啡稽延性戒斷癥狀的治療提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)♂性SD大鼠，月齡2月左右，體重160～200 g，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXX-(渝)2007-015。

1.2 試劑與儀器 鹽酸嗎啡注射液:沈陽(yáng)第一制藥廠;丁螺環(huán)酮片:徐州恩華藥業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司(實(shí)驗(yàn)時(shí)配成15 mg/12.5 mL的溶液);鹽酸納洛酮注射液:江蘇恩華藥業(yè)集團(tuán)有限公司;CR:廣東省珠海瑞樺戒毒康復(fù)中心，實(shí)驗(yàn)時(shí)分別配成100 mg、200 mg、300 mg/12.5 mL 3種濃度的溶液;CaMK II試劑盒(CST公司)，P-CaMK II試劑盒(R＆D公司);高架十字迷宮(成都泰盟科技公司)，實(shí)驗(yàn)時(shí)紅外裝置自動(dòng)跟蹤，相關(guān)軟件自動(dòng)記錄數(shù)據(jù)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 清潔級(jí)大鼠96只，隨機(jī)分成7組，即生理鹽水(NS)對(duì)照組、嗎啡焦慮模型組(模型組)、NS治療組、丁螺環(huán)酮組(Bus組)、CR高、中、低劑量組，除NS對(duì)照組和模型組大鼠為18只外，余每組均為12只。

2.2 藥物治療 確認(rèn)大鼠嗎啡依賴模型建立成功［3］后，實(shí)驗(yàn)11～13 d行嗎啡自然戒斷，同時(shí)CR高、中、低劑量組大鼠分別以 300、200、100 mg/kg的 CR 、Bus組以 15 mg/kg的Bus、NS治療組則以等體積NS ig治療(均2次/d)，模型組不給任何處理。

2.3 高架十字迷宮檢測(cè)大鼠焦慮行為 在第13天(即末次嗎啡注射后72 h)，各組大鼠行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。在5 min內(nèi)記錄下述數(shù)據(jù):①進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù);②在開(kāi)臂停留時(shí)間;③進(jìn)入閉臂的次數(shù);④在閉臂停留時(shí)間。再由以上①～④分別計(jì)算出:(1)進(jìn)入開(kāi)臂和閉臂的總次數(shù)(OE+CE);(2)在開(kāi)臂和閉臂停留的總時(shí)間(OT+CT);(3)進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)比例 (OE%):即OE/(OE+CE)×100%;(4)開(kāi)臂停留時(shí)間比例(OT%):即OT/(OT+CT)×100%.

2.4 蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)CaMK II的含量與磷酸化水平 將迷宮測(cè)試后的各組大鼠斷頭處死，依照大鼠腦立體定位圖譜［4］取海馬、杏仁核、伏核腦組織置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

CaMK II的含量與磷酸化水平的測(cè)定:分別按CaMK II及P-CaMK II試劑盒說(shuō)明檢測(cè)CaMK II含量與磷酸化水平，此試劑盒根據(jù)說(shuō)明書(shū)可同時(shí)分別檢測(cè)CaMK II的α、β兩個(gè)亞基的磷酸化水平。PWIN60軟件分析并進(jìn)行積分光密度值(IOD)測(cè)定。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所得數(shù)據(jù)均用SPSS 16.0 for windows軟件統(tǒng)計(jì)處理，多組資料的比較采用單因素方差分析(ONEWAY ANOVA)進(jìn)行檢驗(yàn)，兩組資料的比較，采用兩兩比較t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)用±s表示。

3 結(jié)果

3.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表1數(shù)據(jù)可見(jiàn):①模型組的OE% 、OT%值顯著低于NS對(duì)照組，表明應(yīng)用嗎啡的大鼠在戒斷后72 h呈現(xiàn)出了明顯的焦慮反應(yīng)。;②與NS治療組比較，CR 300、200 mg/kg組和Bus組的OE% 、OT%值均增高(P＜0.01、P＜0.05)，CR 100 mg/kg雖然也增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);并且CR 300、200 mg/kg組的OE%、OT%值與Bus組接近。說(shuō)明CR具有明顯減輕嗎啡戒斷所引起的焦慮。

表1 各組大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s，n=12)

表1 各組大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s，n=12)

與 NS對(duì)照組比較，★P＜0.01;☆P＜0.05，與 NS治療組比較，▲P＜0.01;△P ＜0.05。

OE+CE OT+CT OE% OT%NS對(duì)照組14.58±4.01 204.50±38.93 0.60±0.10▲0.51±0.10△模型組 15.08±3.55 206.75±20.35 0.35±0.09★0.34±0.06☆NS治療組15.18±3.65 199.16±25.78 0.36±0.18★0.35±0.08☆Bus組 14.75±3.67 204.25±28.15 0.56±0.12▲0.53±0.09△CR 300 mg14.44±4.07 206.77±18.34 0.57±0.11▲0.51±0.07△CR 200 mg13.91±3.89 206.41±28.40 0.59±0.09▲0.53±0.07△CR 100 mg15.00±3.69 204.27±21.00 0.36±0.09☆0.35±0.05☆

3.2 CaMK II含量 模型組海馬、杏仁核和伏核神經(jīng)細(xì)胞CaMK II的IOD值較NS對(duì)照組顯著增高(P＜0.01)，這說(shuō)明在嗎啡戒斷焦慮的大鼠，其CaMK II的含量增加。與NS治療組比較，Bus、CR 300、200 mg/kg組的 CaMK II的 IOD 值明顯降低(均P＜0.01)，(見(jiàn)表2)。

表2 各組大鼠海馬、杏仁核、伏核神經(jīng)細(xì)胞CaMK II含量的I(OD)值(±s，n=12)

表2 各組大鼠海馬、杏仁核、伏核神經(jīng)細(xì)胞CaMK II含量的I(OD)值(±s，n=12)

與NS對(duì)照組比較，★P＜0.01。與NS治療組比較，▲P＜0.01。

海馬 杏仁核 伏核NS對(duì)照組 77.36±5.75▲ 63.36±4.22▲ 90.26±7.98▲模型組 161.28±8.66★ 142.34±6.89★ 190.24±7.54★NS治療組 151.69±8.47★ 126.91±4.84★ 191.60±6.09★Bus組 68.81±6.24▲ 67.10±5.71▲ 80.86±3.94▲CR 300 mg 58.65±9.66▲ 46.11±6.29▲ 72.08±7.03▲CR 200 mg 60.18±8.76▲ 43.11±4.27▲ 70.24±4.58▲CR 100 mg 146.35±6.66★ 123.47±7.98★ 170.61±5.79★

3.3 CaMK II磷酸化水平

3.3.1 CaMK IIβ亞基的磷酸化水平 與CaMK II的結(jié)果類(lèi)似，模型組海馬、杏仁核和伏核神經(jīng)細(xì)胞CaMK IIβ亞基磷酸化水平的IOD值較NS對(duì)照組顯著增高(P＜0.01)。與NS治療組比較，CR 300、200 mg/kg和Bus組CaMK IIβ亞基磷酸化水平的IOD值明顯降低(均P＜0.01)，CR 100 mg/kg組也降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。同樣，Bus、CR 300、200 mg/kg三組的數(shù)值接近(詳見(jiàn)表3)。

表3 各組大鼠海馬、杏仁核、伏核神經(jīng)細(xì)胞CaMK IIβ亞基磷酸化水平的I(OD)值(±s，n=12)

表3 各組大鼠海馬、杏仁核、伏核神經(jīng)細(xì)胞CaMK IIβ亞基磷酸化水平的I(OD)值(±s，n=12)

與NS對(duì)照組比較，★P＜0.01，NS治療組比較，▲P＜0.01。

海馬 杏仁核 伏核NS對(duì)照組 100.29±4.60▲ 73.73±5.60▲ 108.95±6.65▲模型組 180.73±8.34★ 152.17±5.17★ 221.51±10.11★NS治療組 173.62±8.70★ 141.56±6.69★ 208.71±7.64★Bus組 90.80±7.21▲ 71.60±4.29▲ 120.09±8.65▲CR 300 mg 68.43±6.32▲ 52.45±9.45▲ 100.34±6.79▲CR 200 mg 63.75±6.30▲ 52.76±10.13▲ 94.02±7.68▲CR 100 mg 159.82±8.22★ 139.34±5.71★ 184.32±4.73★

3.3.2 CaMK IIα亞基的磷酸化水平 模型組與生理鹽水組比較，海馬、杏仁核、伏核神經(jīng)細(xì)胞CaMK IIα亞基磷酸化水平的IOD值高，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與NS治療組比較，CR 300、200 mg/kg和Bus組CaMK IIα亞基磷酸化水平的IOD值雖然也降低，同樣也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠海馬、杏仁核、伏核神經(jīng)細(xì)胞CaMK IIα亞基磷酸化水平的IOD值(±s，n=12)

表4 各組大鼠海馬、杏仁核、伏核神經(jīng)細(xì)胞CaMK IIα亞基磷酸化水平的IOD值(±s，n=12)

63.95±3.33 73.23±3.43 124.84±3.96模型組 70.32±3.31 80.48±3.05 131.44±5.44 NS治療組 68.05±4.49 79.59±3.57 128.03±4.65 Bus組 65.78±4.92 76.70±4.41 123.09±3.89 CR 300 mg 67.89±3.06 70.28±2.68 120.81±2.75 CR 200 mg 68.37±2.86 73.25±2.80 121.59±3.39海馬 杏仁核 伏核NS對(duì)照組CR 100 mg 69.73±5.48 76.01±3.78 124.58±3.20

4 討論

曾有學(xué)者根據(jù)向大鼠海馬內(nèi)注射CaMK II抑制劑或CaMK II反義寡核苷酸，能顯著減輕嗎啡的戒斷綜合癥或減輕動(dòng)物對(duì)嗎啡的耐受與依賴，提出了“CaMK II可能成為設(shè)計(jì)戒毒藥物的靶分子”的設(shè)想［5］。但迄今為止，針對(duì)目前應(yīng)用于臨床的戒毒藥物，尤其是復(fù)方中藥(通常認(rèn)為具有多靶點(diǎn)作用)，CaMK II究竟是否為其發(fā)揮藥效作用的一個(gè)靶分子，卻鮮見(jiàn)報(bào)道。我們的實(shí)驗(yàn)觀察到，在嗎啡依賴戒斷焦慮大鼠海馬、杏仁核和伏核神經(jīng)細(xì)胞CaMK II的含量和β亞基磷酸化水平的IOD值明顯增高。經(jīng)治療后，伴隨CR200、300 mg/kg和Bus大鼠的焦慮行為被抑制(這與我們以前的研究結(jié)果一致［2］)，其CaMK II含量和β亞基磷酸化水平的IOD值也下降，與NS對(duì)照組接近，提示CR和Bus抑制嗎啡戒斷后的焦慮反應(yīng)與逆轉(zhuǎn)海馬、杏仁核和伏核神經(jīng)細(xì)胞CaMK II的含量和β亞基的磷酸化水平有一定的相關(guān)性。

CaMK II是一種多功能的蛋白激酶，在腦內(nèi)主要存在α和β兩種異構(gòu)體，主要集中在突觸部位，其功能可參與鈣離子依賴性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，海馬等腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞在嗎啡戒斷發(fā)生時(shí)釋放增加的谷氨酸可激活N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-asparate，NMDA)受體引起Ca2+通道開(kāi)放［6］，大量的Ca2+內(nèi)流增加與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合，可影響CaMKⅡ的含量及磷酸化水平。復(fù)方瑞康欣含有的這些藥物大多含有鈣離子拮抗劑(如延胡索乙素、川芎嗪等)，可通過(guò)拮抗嗎啡戒斷焦慮大鼠神經(jīng)細(xì)胞鈣離子濃度的升高，繼使CaMKⅡ的含量及磷酸化水平恢復(fù)至正常，從而使焦慮癥狀得以控制。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CR不但對(duì)嗎啡戒斷焦慮大鼠CaMK II含量，而且進(jìn)一步對(duì)其β亞基的磷酸化水平具有下調(diào)作用，提示逆轉(zhuǎn)嗎啡戒斷焦慮大鼠海馬、杏仁核和伏核神經(jīng)細(xì)胞CaMK II的含量和β亞基磷酸化水平，可能是CR臨床治療嗎啡戒斷焦慮/稽延性戒斷癥狀的分子機(jī)制之一。

致謝 廣東省珠海瑞樺戒毒康復(fù)中心李曉東老師(現(xiàn)工作單位:珠海金鼎戒毒中心)對(duì)本課題的幫助。

［1］李曉東，麥創(chuàng)富，鄧菊平，等.中藥瑞康欣膠囊的質(zhì)量和在戒毒中的療效觀察［J］.中國(guó)藥物濫用防治雜志，2007，13(4):194-195.

［2］何繼鋒，錢(qián) 剛，羅素元.復(fù)方瑞康欣膠囊對(duì)嗎啡依賴戒斷焦慮大鼠行為及海馬突觸素表達(dá)的影響［J］.中草藥，2009，40(5):763-767.

［3］高家林，羅素元，何繼鋒.大鼠嗎啡依賴戒斷后焦慮模型的建立和評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)藥物依賴性雜志，2009，18(5):388-392.

［4］包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:32-35.

［5］唐開(kāi)福，張銀輝，袁建剛，等.CaMK II在學(xué)習(xí)和記憶中的作用［J］. 生物工程進(jìn)展，2001，21(2):50-53.

［6］Koinig H，Vornik V，Rueda C，et al.Lubeluzole inhibits accumulation of extracellular glutamate in the hippocampus during t ransient global cerebral ischemia［J］.Brain Res，2001，898(2):297-302.