黃立標(biāo)， 馮錦東* ， 王德立， 歐淑玲

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所海南分所，海南海口571533;2.海南省南藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71533)

肉豆蔻(Myristica fragrans Houtt)為肉豆蔻科植物，雌雄異株，以種仁入藥，中醫(yī)認(rèn)為有溫中澀腸，行氣消食等功效［1］。其果肉油具有止瀉、鎮(zhèn)靜作用［2］，原產(chǎn)地以該植物作香料。肉豆蔻主要分布于印度尼西亞、馬來(lái)西亞、西印度群島、巴西等地。1986年肉豆蔻在海南引種成功，至今已有20多年的種植經(jīng)驗(yàn)。

目前對(duì)肉豆蔻的研究主要集中在果肉和種仁揮發(fā)油含量測(cè)定和成分分析等方面，其中單萜及其衍生物占揮發(fā)油成分較大比例。王瑩［3］從不同省份采購(gòu)的商品肉豆蔻揮發(fā)油中鑒定出79個(gè)化合物，其中肉豆蔻醚和萜類(lèi)為其主要成分。黃鑫等［4］從不同炮制品肉豆蔻揮發(fā)油中分析鑒定出76個(gè)化合物，其中單萜類(lèi)占揮發(fā)油的69.15% ～97.24%。此外肉豆蔻炮制品中還含有丁香酚類(lèi)物質(zhì)［5］。前人對(duì)其果實(shí)和種仁揮發(fā)油研究較多，而對(duì)葉或花的研究相對(duì)較少。Lavanya Madhavan［6］對(duì)肉豆蔻葉進(jìn)行了葉油和花油的化學(xué)成分研究，葉揮發(fā)油含量較果實(shí)低。陳迪華［7］對(duì)海南引種肉豆蔻與馬來(lái)西亞肉豆蔻種子和葉揮發(fā)油進(jìn)行了對(duì)比研究，表明葉也含有較為豐富的揮發(fā)油?？梢?jiàn)海南產(chǎn)肉豆蔻葉是值得開(kāi)發(fā)的良好材料。

肉豆蔻在海南引種栽培亦有研究。對(duì)肉豆蔻在海南引種栽培的氣候適應(yīng)性分析表明海南有較大面積適宜該物種的栽培［8］。隨著研究的深入和種植面積的擴(kuò)大，對(duì)其品質(zhì)評(píng)價(jià)和適宜采收期研究有利于指導(dǎo)規(guī)?；a(chǎn)及資源的合理利用。本研究對(duì)肉豆蔻葉揮發(fā)油及其主要成分進(jìn)行研究，首次揭示了海南肉豆蔻葉揮發(fā)油及其主要成分全年動(dòng)態(tài)變化，以選擇適宜采收期，對(duì)肉豆蔻規(guī)范化種植和資源開(kāi)發(fā)有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器:Agilent5973-6890氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，色譜條件:HP-5 msi毛細(xì)管色譜柱(0.25 mm ×30 m，0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度240 ℃，升溫程序:初溫40℃，以5℃/min速度升溫到280℃，載氣為高純氦氣，流量 1 μL/min，進(jìn)樣量 1 μL，分流比 30∶1，EI電離源，70 ev，離子源溫度 230，柱前壓 7.4 psi，掃描范圍:35 ～550。

肉豆蔻(Myristica fragrans Houtt):1986年引種至海南省興隆南藥園的肉豆蔻及其多年生無(wú)性繁殖材料。

1.2 方法

1.2.1 肉豆蔻葉揮發(fā)油含量動(dòng)態(tài)變化 選擇雌、雄肉豆蔻樹(shù)各3株，2008年每月上旬均勻采摘新鮮樹(shù)葉500 g，參照2005年版《中華人民共和國(guó)藥典》中的附錄XD方法［2］提取揮發(fā)油，用無(wú)水硫酸鈉干燥后，計(jì)算其含油量，重復(fù)3次。

1.2.2 肉豆蔻葉揮發(fā)油主要成分動(dòng)態(tài)變化 分別選擇 1、3、5、7、9、11 月份的葉揮發(fā)油用 1.1 項(xiàng)中的氣質(zhì)聯(lián)用儀分析和條件測(cè)定主要成分及含量。對(duì)總離子流圖的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，經(jīng)過(guò)安捷倫色譜工作站NIST05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索，確定各化合物;按峰面積歸一化法計(jì)算揮發(fā)油中各化合物成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌、雄肉豆蔻葉揮發(fā)油含量動(dòng)態(tài)變化 肉豆蔻葉揮發(fā)油含量1年內(nèi)變化趨勢(shì)，雌、雄植株有相似也有差異(圖1)。雄株葉揮發(fā)油含量1～4月逐漸增加，4月最高為0.50%，此后逐漸降低;而雌株在4月和10月出現(xiàn)兩次高峰值，均為0.45%，其它月份變化較平穩(wěn)。進(jìn)一步對(duì)所有月份葉油含量進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明:雄株葉揮發(fā)油含量4月和10月差異不顯著(P＜0.05)，而與其它月份均有顯著性差異(表1:分別列出雌雄植株較高2個(gè)月份同其它月份的比較結(jié)果)。此外12月份其含量與其它月份也有顯著性差異，為次高峰值;雌株在4月和11月葉揮發(fā)油含量出現(xiàn)兩次高峰，而4月顯著高于其它月份(P＜0.05)，且與部分月份存在極顯著差異。11月份略低，與1、2、6、10 月份差異不顯著，其余均有顯著差異?？傊?，雄株葉揮發(fā)油4月和10月最高，而雌株僅4月最高。此外，雌株葉揮發(fā)油含量同月份比較發(fā)現(xiàn)，除10月份二者差異不顯著外，其它月份雌株顯著高于雄株(P＜0.05)。

圖1 不同月份雌雄肉豆蔻葉油含量Fig.1 The leaf oil contents of male and female plant in different months

表1 部分月份葉揮發(fā)油含量多重比較Tab.1 Multiple comparisons of leaf oil from leaves in some months

2.2 肉豆蔻葉揮發(fā)油主分動(dòng)態(tài)變化 通過(guò)GC-MS檢測(cè)，分離得到主要物質(zhì)為單萜及其衍生物，其中α-蒎烯和 4-萜烯醇為含量較高的兩種化合物(表2)。肉豆蔻葉揮發(fā)油總離子流色譜圖見(jiàn)圖2。

表2 不同月份肉豆蔻葉揮發(fā)油中α-蒎烯和4-萜烯醇的含量Tab.2 The contents of α-pinene and 4-terpenol in leaf oil in different months

圖2 肉豆蔻葉油總離子色譜圖(雌株)Fig.2 The total lon current chromatogram of leaf oil of Myristica fragrans Houtt(female)

圖3 不同月份雄株肉豆蔻葉油中α-蒎烯、4-萜烯醇、單萜及其衍生物含量(雄株)Fig.3 The contents of α-pinene，4-terpenol and monoterpenoids and their derivative in leaf oil in different months(male)

2.2.1 雄株葉揮發(fā)油主要成分動(dòng)態(tài)變化 雄株，葉揮發(fā)油主要成分含量不同月份變化明顯(圖3)，單萜及其衍生物含量于1月最高為90.00%，其次為11月80.60%，其它月份略有變化，7月最低僅為60.10%;α-蒎烯含量于5月最高達(dá)29.24%，7月最低僅9.10%;4-萜烯醇9月最高為13.84%，11月最低為9.49%，其它月份變化不明顯。葉中揮發(fā)油含量最高時(shí)間與單萜及其衍生物含量變化基本同步，而α-蒎烯與4-萜烯醇含量變化與總揮發(fā)油有明顯差異。因此在生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)需要適時(shí)采收。

2.2.2 雌株葉揮發(fā)油主要成分動(dòng)態(tài)變化 雌株，葉揮發(fā)油中單萜及其衍生物含量于5月和11月較高，分別達(dá)86.20%與86.10%，其次為3月為83.00%，7月最低僅60.90%;α-蒎烯5月最高達(dá)29.24%，9月最低為11.49%;4-萜烯醇最高為9月18.20%，其次為11月13.58%，1月最低僅11.93%。雌株葉中揮發(fā)油含量4、5月最高，單萜及其衍生物在5月和11月均較高，其中α-蒎烯變化不穩(wěn)定，4-萜烯醇卻在單萜及其衍生物含量較低時(shí)其含量最高，二者變化也不同步。見(jiàn)圖4。

圖4 不同月份雌株肉豆蔻葉油中α-蒎烯、4-萜烯醇、單萜及其衍生物含量(雌株)Fig.4 The contents of α-pinene ，4-terpenol and monoterpenoids and their derivative in leaf oil in different months(female)

3 討論

3.1 雌雄肉豆蔻葉揮發(fā)油含量動(dòng)態(tài)變化 肉豆蔻通常以成熟種子入藥，前人對(duì)果實(shí)揮發(fā)油含量及成分研究較多。早期對(duì)海南產(chǎn)肉豆蔻葉揮發(fā)油含量與馬來(lái)西亞材料進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)二者主要化學(xué)成分大致相同，但相對(duì)含量存在差異，并測(cè)定出葉含有較高的揮發(fā)油，可以開(kāi)發(fā)利用［7］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)海南產(chǎn)肉豆蔻葉揮發(fā)油及主要成分含量全年動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其主要成分同樣為單萜及其衍生物，其中α-蒎烯和4-萜烯醇的含量非常高，這與前人研究結(jié)果基本一致，表明肉豆蔻葉是值得開(kāi)發(fā)的良好材料。對(duì)雌、雄植株葉揮發(fā)油含量年內(nèi)動(dòng)態(tài)變化研究表明:雌、雄植株葉揮發(fā)油含量存在明顯差異，雌株含有更高的揮發(fā)油;雄株葉揮發(fā)油含量在4月和10月最出現(xiàn)兩次高峰，其它月份略有變化，但不明顯;而雌株葉揮發(fā)油含量從1～4月逐漸增加，4月最高，隨后逐漸降低，8～12月變化不明顯。因此提取葉揮發(fā)油應(yīng)選擇含油量較高的月份采集葉片。

雌、雄植株葉揮發(fā)油含量比較發(fā)現(xiàn)，除10月相同外，其它月份雌株均高于雄株，因此在資源充足的情況下雌株葉更適于利用。本研究首次明確了雌雄植株葉揮發(fā)油含量存在明顯差異及動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，揭示了海南引種的肉豆蔻葉的適宜采收期，有利于引種栽培及資源合理利用。

3.2 肉豆蔻葉揮發(fā)油主要成分動(dòng)態(tài)變化 海南產(chǎn)肉豆蔻葉揮發(fā)油主要成分為單萜及其衍生物，占總揮發(fā)油的60%～90%，且與種仁揮發(fā)油有多種相似成分，只是含量存在一定差異，這與前人研究相似［4，9］，表明肉豆蔻葉是提取揮發(fā)油良好材料。本研究在分析肉豆蔻葉揮發(fā)油及其主要成分動(dòng)態(tài)變化基礎(chǔ)上，明確了肉豆蔻葉適宜采收月份。今后將圍繞肉豆蔻葉揮發(fā)油及主要成分年動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，確定適宜采收年限。

雄株葉揮發(fā)油中單萜及其衍生物含量1月最高，此后迅速降低，5月與11月稍有增加;而α-蒎烯與4-萜烯醇與之具有較大差異，5月α-蒎烯含量明顯高于其它月份，此時(shí)為植株旺盛生長(zhǎng)期，可能與該物質(zhì)的合成酶活性有密切關(guān)系;4-萜烯醇含量9月最高。雌株葉揮發(fā)油中單萜及其衍生物含量在5月與11月最高，α-蒎烯含量與之有相似的變化趨勢(shì)，但變化較小，含量相對(duì)穩(wěn)定。4-萜烯醇含量變化較為明顯，在單萜及其衍生物含量較低的9月最高，其它月份變化較小。雌雄植株葉揮發(fā)油、單萜類(lèi)物質(zhì)、α-蒎烯及4-萜烯醇含量在全年變化趨勢(shì)差異較大，因此應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)目的選擇合適的時(shí)間采收。

雌雄植株葉揮發(fā)油中4-萜烯醇含量均于9月最高，而此時(shí)葉揮發(fā)油及單萜類(lèi)物質(zhì)含量均未達(dá)到高峰值;α-蒎烯含量，在雌雄植株間和不同月份間均存在明顯的變化。表明葉揮發(fā)油成分種類(lèi)和含量在不同時(shí)期存在較大差異，因此深入全面研究葉揮發(fā)油中各種成分的動(dòng)態(tài)變化有利于資源開(kāi)發(fā)和合理利用。

［1］中醫(yī)藥管理局中華本草編委.中華本草［M］.三冊(cè).上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:12-17.

［2］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:附錄:57-58.

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［5］賈天柱，沙 明，曹愛(ài)民，等.肉豆蔻不同炮制品揮發(fā)油中丁香酚類(lèi)成分測(cè)定［J］.中國(guó)中藥雜志，1997，22(8):474-475.

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［9］王 瑩，楊秀偉.印度尼西亞產(chǎn)肉豆蔻揮發(fā)油成分的GC-MS分析［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22(9):603-606.