毛楊毅,羅惠娣,郭慧慧,張喜中,王志武,李 俊,王棟才,張冠武,韓一超,田 輝

(山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所,太原 030032)

山西省是我國養(yǎng)羊大省,具有豐富的山羊品種資源。黎城大青羊、陽城白山羊、呂梁黑山羊[1-2]以及洪洞奶山羊都是山西著名的山羊業(yè)的主要生產(chǎn)資料,具有生產(chǎn)性能良好、適應性強、耐粗飼等優(yōu)良品質(zhì)。近年來,為適應羊肉生產(chǎn)發(fā)展的需要,引入波爾山羊及南江黃羊等與本地品種進行了試驗性雜交,以期建立成熟的雜交繁育生產(chǎn)體系,為山西山羊羊肉生產(chǎn)奠定基礎。在山羊生產(chǎn)實踐中,雜種優(yōu)勢的預測及其利用日益重要,但傳統(tǒng)的雜種優(yōu)勢預測需要進行雜交試驗和配合力測定,既費時又費力。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,基于DNA多態(tài)性的分子標記的產(chǎn)生為解決這些問題開創(chuàng)了新的途徑。

微衛(wèi)星是DNA序列中以2～6個短核苷酸為基本單位,重復10～20次,分布于生物整個基因組。因數(shù)量多、分布廣、多態(tài)性豐富、呈共顯性遺傳以及檢測快速方便等優(yōu)點而倍受推崇,已被廣泛應用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀基因定位、遺傳多樣性評估等方面。此外,微衛(wèi)星DNA多態(tài)性還被應用于動物雜交優(yōu)勢的預測。通過各品種在不同微衛(wèi)星座位的等位基因頻率計算出品種間的遺傳距離,了解其血緣關系的遠近以預測雜種優(yōu)勢的大小。

在國內(nèi)其它省區(qū),瞿冬艷等[3]用微衛(wèi)星DNA對寧夏牧區(qū)主要綿羊群體的遺傳多態(tài)性進行了分析,并據(jù)此預測了雜種優(yōu)勢;張英杰等[4]則在利用微衛(wèi)星DNA分析3個山羊群體和部分綿羊品種遺傳多態(tài)性的基礎上,對預測的雜種優(yōu)勢進行了實際雜交驗證。武艷平等[5]用微衛(wèi)星標記研究我國部分山羊群體遺傳結(jié)構(gòu)變異;李步高等[6]、常新建等[7]分別用RAPD技術(shù)和微衛(wèi)星標記分析山西省部分山羊品種和外來部分山羊品種的遺傳親緣關系。但用微衛(wèi)星標記對山西省4個地方山羊品種及波爾山羊的遺傳多樣性及親緣關系進行系統(tǒng)研究未見報道。本研究利用微衛(wèi)星DNA從分子水平上分析5個山羊品種的遺傳多態(tài)性,計算了群體間的遺傳距離,據(jù)此對波爾山羊與4個地方品種間的雜種優(yōu)勢做了預測,旨在為山西省進行山羊雜交改良、新品種培育等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測樣品 2008年3—11月,在各品種內(nèi)采取特征明顯的40只羊的耳組織樣品,共采集樣品200份,放進裝有70%～75%酒精的保溫壺中帶回實驗室。其中黎城大青羊(LC)采自黎城縣種羊場,陽城白山羊(YC)采自陽城白山羊種羊場,呂梁黑山羊(LL)采自興縣高效生態(tài)養(yǎng)羊繁殖示范基地,洪洞奶山羊(HD)采自洪洞奶山羊育種場,波爾山羊(Boer)采自山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所種羊場。

1.1.2 微衛(wèi)星座位及引物序列 微衛(wèi)星座位、引物序列、染色體位置等相關信息均來自www.ncbi.nlm.nih.gov和www.marc.usda.gov兩個網(wǎng)站,見表1。引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 5對微衛(wèi)星引物的信息

1.1.3 主要試劑 10×buffer、dNTP 、Mg2+、Taq酶、T ris平衡酚、丙烯酰胺等試劑均由太原市來寶生物工程有限公司提供;pBR322 DNA/Msp1由天根生化科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用酚-氯仿抽提法[8]。

1.2.2 PCR擴增 PCR反應體系:反應體系10 μ L,其中各組分的終濃度或劑量分別為:1～2×buffer,dNTPs 100～400μ M,primer 1和primer 2各0.2～0.4 μ M,Mg2+1.5 ～ 2.0 mM,Taq 酶 0.5～ 1.0 u,基因組DNA 20～40 ng。PCR反應程序:94℃預變性5 min;94℃變性 30 s,50～64℃退火 50 s,72℃延伸 1 min,共35個循環(huán);72℃終末延伸5 min。

1.2.3 等位基因分離及大小計算 用8%～12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離微衛(wèi)星等位基因,經(jīng)硝酸銀染色后,用WD-9413A凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。再以pBR322 DNA/Msp1 Marker為標準,利用ONE-Dscan軟件計算等位基因大小。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 參考引用相關文獻[9],對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。利用 Mstools、Fstat、Popgene、dispan 等軟件計算每個品種在各位點等位基因頻率(P)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、總?cè)后w遺傳分化系數(shù)(Gst)、品種間標準遺傳距離(DS)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離 將5個山羊品種在5個微衛(wèi)星位點PCR擴增產(chǎn)物用8%～12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離DNA片段,PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果參見圖1。從圖1可見,PCR產(chǎn)物擴增以及基因分離效果良好。根據(jù)等位基因片段大小分別記錄為 a、b、c、d……等。

圖1 呂梁黑山羊(LL)BM6526位點PCR擴增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.2 品種的遺傳多樣性 由表2可知,5個微衛(wèi)星位點在5個山羊品種中共檢測到70.0個等位基因,各位點檢測到等位基因數(shù)9.0～21.0個,平均14.0個。黎城大青羊、陽城白山羊、呂梁黑山羊、洪洞奶山羊、波爾山羊在5個微衛(wèi)星位點檢測到的等位基因數(shù)分別為:46.0、37.0、42.0、35.0、36.0個。依據(jù)等位基因組成,運用Mstools軟件計算等位基因頻率。

表2 5個山羊品種各微衛(wèi)星位點等位基因數(shù)

各品種在各位點觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)及平均 Ho、He、PIC、Ne等(表3)的計算,基于等位基因組成及頻率,運用Mstools和popgene軟件。5個微衛(wèi)星座位的有效等位基因數(shù)3.33～15.46個,平均7.99個。BM6526座位最多,MB056座位最少。5個山羊品種在5個微衛(wèi)星位點平均有效等位基因數(shù)順序為:黎城大青羊＞呂梁黑山羊＞陽城白山羊＞波爾山羊＞洪洞奶山羊。

利用5個微衛(wèi)星標記在檢測5個山羊品種遺傳多態(tài)信息含量時,除MB056位點在洪洞奶山羊多態(tài)信息含量0.444 6(0.25＜PIC＜0.5)為中度多態(tài)位點外,其它PIC＞0.5均為高度多態(tài)位點。5個山羊品種在5個微衛(wèi)星位點平均遺傳多態(tài)信息含量以黎城大青羊最高,洪洞奶山羊最低。

各微衛(wèi)星位點基因雜合度在0.701 7～0.937 6之間,BM6526位點較大,MB056位點較小;5個山羊品種在5個微衛(wèi)星位點平均基因雜合度順序為:黎城大青羊＞陽城白山羊＞呂梁黑山羊＞波爾山羊＞洪洞奶山羊。此結(jié)果與多態(tài)信息含量結(jié)果相一致。

表3 5個山羊品種在各微衛(wèi)星位點的有效等位基因數(shù)、基因雜合度、多態(tài)信息含量

2.3 品種間遺傳分化 根據(jù)等位基因組成及頻率,使用popgene、dispan軟件,計算出在5個微衛(wèi)星點在各山羊品種間遺傳分化系數(shù)(表4)、標準遺傳距離(表5)。由表4可知,在5個微衛(wèi)星位點上,URB037位點遺傳分化系數(shù)最大(0.080 6),MB056位點最小(0.030 6),平均0.060 7。表明5個微衛(wèi)星位點上各山羊品種間遺傳變異占總?cè)后w遺傳變異的6.07%,93.93%遺傳變異發(fā)生在品種內(nèi),可見品種間遺傳變異不大。

由表5可知,波爾山羊與呂梁黑山羊遺傳距離最大(0.508 3),與陽城白山羊(0.447 4)和洪洞奶山羊(0.433 2)次之,與黎城大青羊最小(0.330 1);黎城大青羊與陽城白山羊間遺傳距離最小(0.082 0),依次為黎城大青羊、陽城白山羊與呂梁黑山羊(0.107 0)、(0.153 0),呂梁黑山羊、陽城白山羊、黎城大青羊與洪洞奶山羊(0.304 2)、(0.337 4)、(0.353 5),波爾山羊與黎城大青羊、洪洞奶山羊、陽城白山羊、呂梁黑山羊間為最大。

表4 5個微衛(wèi)星位點的總?cè)后w基因多樣度(Ht)、群體內(nèi)基因多樣度(Hs)及基因分化系數(shù)(Gst)

表5 5個山羊品種間遺傳距離

3 討論

3.1 品種遺傳變異分析 等位基因是衡量微衛(wèi)星座位多態(tài)性的一個重要參數(shù)。根據(jù)微衛(wèi)星標記選擇標準,每個微衛(wèi)星位點至少應有4個等位基因方能較好地用于遺傳多樣性的評估[10]。本研究結(jié)果為:5個山羊品種在各微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)都在4.0個以上,各位點檢測到的等位基因數(shù)為9.0～21.0個,均比報道的多,說明選擇的5個微衛(wèi)星座位多態(tài)性豐富,可用于5個山羊品種遺傳多樣性的評估。

有效等位基因數(shù)(Ne)、基因雜合度(H)、遺傳多態(tài)信息含量(PIC)都是衡量品種內(nèi)遺傳變異程度及座位多態(tài)信息量的指標[11]。趙艷紅等[12]、武艷平等[5]、常新建等[7]、王杰等[13]、潘建文等[14]用微衛(wèi)星標記分別分析了中國部分山羊群體及山西、四川、福建省部分地方山羊品種的遺傳多樣性,結(jié)果為:中國6個山羊群體平均有效等位基因數(shù)為2.571～4.915個,平均多態(tài)信息含量在0.533 0～0.639 0之間,平均遺傳雜合度在0.367 0～0.467 0之間;我國5個山羊品種平均有效等位基因數(shù)為4.66～6.05個,平均多態(tài)信息含量在0.724 0～0.784 0之間,平均遺傳雜合度在0.768 0～0.820 0之間;5個山羊群體平均有效等位基因數(shù)為7.776 5～11.506 0個,平均多態(tài)信息含量在0.834 1～0.902 6之間,平均遺傳雜合度在0.859 4～0.911 5之間;四川9個黑山羊品種平均有效等位基因數(shù)4.273～5.281個,平均多態(tài)信息含量在0.697 0～0.770 0之間,平均遺傳雜合度在0.742 0～0.801 0之間;福建地方山羊品種平均有效等位基因數(shù)4.46～5.60個,平均多態(tài)信息含量在0.729 4～0.780 8之間,平均遺傳雜合度在0.767 2～0.807 9之間。本研究的結(jié)果為:5個山羊品種平均有效等位基因數(shù)為4.94～6.05個,平均遺傳多態(tài)信息含量在0.705 3～0.798 2之間,平均基因雜合度在0.759 2～0.831 6之間?？梢姳狙芯拷Y(jié)果與武艷平等[5]、王杰等[13]、潘建文等[14]的結(jié)果相似,略高于趙艷紅等的結(jié)果[12],略低于常新建等的結(jié)果[7]。結(jié)果表明,5個山羊品種遺傳變異程度高、多態(tài)性豐富及選擇潛力大;5個微衛(wèi)星位點均為高度多態(tài)位點、多態(tài)信息量大,能夠從分子水平上反映5個山羊品種內(nèi)遺傳變異及品種間遺傳關系,可作為有效遺傳標記用于山羊品種的遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建分析。

另外,在5個山羊品種中,黎城大青羊的平均有效等位基因數(shù)、基因雜合度、多態(tài)信息含量3項指標最大,而洪洞奶山羊最小,表明黎城大青羊的遺傳變異程度較其它4個山羊品種大,而洪洞奶山羊則小。這可能是洪洞奶山羊目前數(shù)量較少、遺傳資源不廣泛造成的原因。

3.2 品種間親緣關系分析 遺傳距離是度量品種間、物種間遺傳變異及基因差異程度的某種數(shù)值。李步高等[6]、常新建等[7]分別用RAPD技術(shù)、微衛(wèi)星標記研究波爾山羊與山西部分地方山羊品種間遺傳距離,結(jié)果均為波爾山羊與呂梁黑山羊間遺傳距離大于與黎城大青羊間遺傳距離。本實驗結(jié)果:波爾山羊與山西4個地方山羊品種間標準遺傳距離(DS)順序為:波爾山羊與呂梁黑山羊＞波爾山羊與陽城白山羊＞波爾山羊與洪洞奶山羊＞波爾山羊與黎城大青羊。此結(jié)果與李步高等[6]、常新建等[7]研究結(jié)果基本一致。

3.3 雜種優(yōu)勢推測 雜種優(yōu)勢理論認為[15],雜種優(yōu)勢的大小在一定程度上取決于親本間的遺傳差異大小,即親本間遺傳距離。遺傳距離越大,遺傳分化越大,雜交優(yōu)勢越大,雜交效果越好。瞿冬艷等[3]用微衛(wèi)星標記分析寧夏牧區(qū)主要綿羊群體間遺傳距離,并預測雜種優(yōu)勢;張英杰等[4]在用微衛(wèi)星DNA分別進行3個山羊群體間、5個綿羊品種間遺傳距離分析的基礎上,對預測的雜種優(yōu)勢做了實際雜交驗證。李步高等[6]用RAPD技術(shù)對波爾山羊與山西部分地方山羊品種間遺傳距離進行研究,得出波爾山羊與呂梁黑山羊的雜種優(yōu)勢較與其它幾個品種大。據(jù)本研究結(jié)果,波爾山羊與呂梁黑山羊雜交,可望獲得較大的雜種優(yōu)勢,與陽城白山羊和洪洞奶山羊的雜種優(yōu)勢次之,與黎城大青羊的雜種優(yōu)勢較小。此結(jié)果與李步高等[6]研究結(jié)果基本一致。

致謝:黎城縣種羊場、陽城白山羊種羊場、興縣高效生態(tài)養(yǎng)羊繁殖示范基地、洪洞奶山羊育種場的同仁們對本文采集樣品的支持。

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