李亮亮,杜 珊,劉 軍,趙曉鵝,馬保華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

克隆,即無性繁殖,是通過無性形式由單個細胞產(chǎn)生和親代非常相像的單個動物后代。這里所說的單個細胞從來源上既可以是體細胞,也可以是胚胎細胞；從年齡上看,既可以是成年細胞,也可以是幼年或胎兒細胞。在高等哺乳動物中,細胞核移植技術(shù)是生產(chǎn)克隆動物最為有效的克隆技術(shù),因此,動物克隆技術(shù)實際上是指細胞核移植技術(shù)。

哺乳動物細胞克隆是20世紀末生命科學(xué)領(lǐng)域最引人注目的高新技術(shù),已經(jīng)在畜牧業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥生產(chǎn)和疾病治療、生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究、野生珍貴瀕危動物的保護以及轉(zhuǎn)基因工程等諸多領(lǐng)域蘊藏巨大的潛力。通過科學(xué)研究者近十年的努力,哺乳動物的克隆技術(shù)在農(nóng)業(yè)和生物制藥等方面取得了劃時代的進步,展示了克隆技術(shù)的巨大應(yīng)用價值和廣闊的發(fā)展前景。

自1997年首次獲得體細胞克隆綿羊[1]以來,已經(jīng)有牛[2]、小鼠[3]、山羊[4]、豬[5]、兔[6]、貓[7]、騾子[8]、馬[9]、大鼠[10]、狗[11]等多種克隆動物相繼問世,雖然動物克隆已經(jīng)在多種動物上取得成功,但是克隆技術(shù)目前仍存在一些問題,如效率低、出生的動物存在生理缺陷等多方面的問題,積極尋求問題的解決方法是關(guān)鍵所在。

哺乳動物體細胞核移植技術(shù)形成了一套比較完善的程序,主要包括：核受體胞質(zhì)的準備、核供體細胞的選擇和處理、重構(gòu)胚的構(gòu)建、重構(gòu)胚激活、重構(gòu)胚的培養(yǎng)等。

1 供體細胞因素

1.1 供體細胞的類型

自1997年Wilmut I等利用成年綿羊乳腺細胞克隆出綿羊“多莉”以來,人們已分別利用不同的細胞克隆出山羊、豬、貓、兔、騾、馬、大鼠和狗等哺乳動物。但是,不同的細胞類型,對克隆的成功率影響很大。

Kato Y等[12]比較了牛同一個體卵母細胞和輸卵管細胞及不同個體體細胞：肝細胞、耳細胞、子宮細胞、表皮細胞、輸卵管細胞及卵母細胞對克隆效果的影響,結(jié)果認為牛的卵丘/顆粒細胞和輸卵管細胞最適合用于牛的核移植。楊素芳等[13]在水牛研究中采用成體成纖維細胞、胎兒成纖維細胞、胎兒皮膚細胞和卵巢顆粒細胞作為供體細胞來源用于核移植。結(jié)果顯示,來源于卵丘/顆粒細胞的重構(gòu)胚,其融合率、卵裂率和囊胚發(fā)育率都高于其他3類細胞。卵丘/顆粒細胞適合作為供體細胞的可能原因：①卵丘細胞是自然靜止在G0/G1期的細胞；②卵丘細胞是包圍在卵母細胞周圍的細胞,核移植后兩者胞質(zhì)更易互融；③卵丘細胞內(nèi)端粒酶活性較高。染色體端粒的長度在核移植胚胎的發(fā)育中可恢復(fù)到正常水平[14]。并且,卵丘細胞與卵母細胞在激素水平上趨于一致,所處組織環(huán)境與子宮內(nèi)環(huán)境相似,利于重構(gòu)胚的發(fā)育生長。

1.2 供體細胞周期

細胞周期對核移植成功率的影響至關(guān)重要?！岸嗬颉闭Q生以后,其研究者認為[1],成功的關(guān)鍵因素之一是供體細胞經(jīng)血清饑餓后,處于G0期,認為這種細胞易于重編程。但是,細胞同步化處理是否是克隆成功的必要條件,并無定論。Cibelli J B等[15]利用非靜止期細胞克隆出了轉(zhuǎn)基因牛。因此認為,處于分裂狀態(tài)的細胞群通過核移植仍具有支持分化細胞發(fā)育到正常個體的能力。Beyhan Z等[16]認為,長時間低血清濃度處理可能破壞核細胞內(nèi)DNA結(jié)構(gòu),影響移植成功率。目前,由于S期細胞處于DNA合成階段,重構(gòu)胚易形成2倍化和4倍化之間的非整倍體動物,而沒有克隆個體的報道以外,其他G1、G2和M 期[17]的細胞都被證明可作為供體,用于克隆研究。

1.3 細胞傳代次數(shù)

細胞的傳代是否利于克隆個體方面的說法不一。但是大多數(shù)研究者使用的是原代培養(yǎng)或短期培養(yǎng)的細胞,認為這類細胞利于核移植胚的發(fā)育。但 Kasinathan等[18]利用傳至18代細胞用于核移植,結(jié)果并未影響移植胚的發(fā)育潛能。Arat S等[19]的研究認為,傳代培養(yǎng)15代的細胞核移植后,囊胚率高于培養(yǎng)10、11、13代的細胞。說明培養(yǎng)代數(shù)高的細胞比代數(shù)低的細胞克隆效率高。究竟是什么機制控制這種高傳代數(shù)高移植效率的發(fā)育呢?目前尚無定論。可能是細胞在傳代過程中,一些老化細胞,如染色體破壞嚴重,DNA結(jié)構(gòu)受損的細胞被淘汰。剩余的細胞具有比較完整的核酸結(jié)構(gòu),對外部環(huán)境有較強適應(yīng)性的細胞保留下來,同時能適應(yīng)核移植過程中的一些機械損傷,最后與卵母細胞融合并發(fā)育成克隆個體。

2 受體細胞的因素

迄今已有3類受體細胞用于核移植培育了后代 ,第1類是去除原核的合子 ,但僅局限于用原核或假原核作為供體。第2類是早期胚胎 ,但也只適合于用具有全能性的卵裂球作為供體。第3類是卵母細胞,也是哺乳動物核移植使用最多的一類受體,這類受體接受各階段胚胎的卵裂球,早期胎兒細胞、體細胞或胚胎干細胞均獲得了后代。

受體細胞的去核是核移植中關(guān)鍵環(huán)節(jié),去核不完全將導(dǎo)致重構(gòu)胚的染色體倍性異常,進而導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常。此外去核過程還會給卵母細胞帶來不同程度的物理和化學(xué)損害,因此不斷優(yōu)化去核方法和選擇適合于不同動物的去核方法有助于提高克隆動物的效率。目前,應(yīng)用比較廣泛的去核方法有盲吸去核法和化學(xué)誘導(dǎo)去核法。

2.1 盲吸去核法

通常,盲吸法去核的時間選擇在第一極體剛排出時,因隨時間延長卵細胞核遠離第一極體,影響去核效率。嚴興榮報道[20],注射hCG 10 h后去小鼠卵核,去核率達90%以上；而12 h后去核,去核率下降22%。不同動物的最佳去核時間不同,牛卵母細胞一般為體外成熟18～20 h后,而豬卵母細胞則在體外成熟44～48 h后為宜。此外,不同動物卵母細胞的結(jié)構(gòu)特點不同,其盲吸法的去核效率也不同。崔奎青[21]利用兔卵母細胞在相差顯微鏡下觀察到染色體的特點,將盲吸法與spingdle view系統(tǒng)結(jié)合,去核率達98.4%,且損失的胞質(zhì)少；因小鼠卵母細胞抗機械損傷能力差,去核后卵母細胞成活率低,小鼠卵母細胞法借助Piez系統(tǒng),去核率高達99%,且成活率也達95%,這種方法對那些抗損傷能力差的動物卵母細胞不失為一種有效的替代盲吸法的機械去核法。

盲吸去核法雖然存在這樣一些不足,但其操作簡捷、迅速,仍是目前哺乳動物克隆普遍采用的方法。該法的不足在于造成胞質(zhì)流失和一些重要因子的丟失,從而影響到核的重編程和重構(gòu)胚的后續(xù)發(fā)育,此外還給卵母細胞帶來機械損傷。

2.2 化學(xué)誘導(dǎo)去核法

其機理是在極體排出階段,采用干擾染色體分離或紡錘體功能的化學(xué)試劑,使所有染色體與紡錘體牢固結(jié)合,同時蛋白合成抑制劑抑制細胞周期蛋白B合成,降低促成熟因子濃度,極體借助于慣性將染色質(zhì)和紡錘體帶出胞外,達到去核的目的。脫羰秋水仙堿(demecolcine,DC)是目前最常用的化學(xué)誘導(dǎo)去核劑。與盲吸法等建立在顯微操作系統(tǒng)基礎(chǔ)之上的機械去核法相比,化學(xué)去核法程序簡單、機械損傷小、胞質(zhì)丟失少、重復(fù)性好、適合大規(guī)模卵母細胞去核,具有很樂觀的應(yīng)用前景。

3 重構(gòu)胚激活因素

重構(gòu)胚的激活是體細胞克隆技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),體細胞克隆胚胎的充分激活是保證胚胎正常發(fā)育的先決條件,只有在去核卵母細胞充分激活的情況下才可以指導(dǎo)移入的核發(fā)生重編程(reprogramming)。目前,動物細胞核移植的總效率很低,這可能與卵母細胞未被充分激活有關(guān)。由于化學(xué)激活方法能大大提高體細胞克隆胚胎的激活效率,許多研究者使用重復(fù)性好、結(jié)果較穩(wěn)定的化學(xué)方法來激活卵母細胞,近年來已成為小鼠、牛、豬、山羊等體細胞克隆成功的重要原因。在此基礎(chǔ)上,科學(xué)家們經(jīng)過不斷的努力,核移植的成功率不斷提高。

常用的重構(gòu)胚的激活物質(zhì)有乙醇、氯化鍶、放線菌酮、離子霉素和6-DMAP。另外還有電激活法。乙醇是發(fā)現(xiàn)較早的一種化學(xué)激活劑,其對卵母細胞的激活主要是通過水解細胞膜上 4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)產(chǎn)生1,4,5-三磷酸肌醇(IP3),從而誘發(fā)細胞內(nèi)源鈣釋放到細胞質(zhì),提高細胞內(nèi)的鈣濃度。盡管乙醇對克隆胚的激活無種間特異性,但不同動物克隆胚對乙醇激活的反應(yīng)不同。關(guān)于氯化鍶(SrCl2)引起激活的機制,有人認為Sr2+作為與Ca2+同族的二價陽離子,可能是通過細胞膜上的Ca2+離子通道進入細胞內(nèi),并進入鈣庫(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等),置換出內(nèi)源鈣,釋放入胞質(zhì)中,引起Ca2+離子波動,導(dǎo)致卵母細胞的激活。放線菌酮是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑,通過作用80 S核糖體抑制肽鏈的移動,從而抑制蛋白質(zhì)的合成；單獨的放線菌酮不能使豬體外成熟卵母細胞激活,其機制尚不清楚,可能是豬卵母細胞對其不敏感,只有與其他刺激因素聯(lián)合使用時,才起到協(xié)同促進的作用,這也說明,放線菌酮引起的卵母細胞激活不是通過Ca2+被動起作用的,而是通過抑制有關(guān)蛋白質(zhì)的合成起作用。SrCl2與放線菌酮聯(lián)合使用對豬卵母細胞的激活有協(xié)同促進作用。離子霉素是一種近年來發(fā)現(xiàn)的高效Ca2+載體,也是一種有效的人工激活劑,已被人們廣泛地應(yīng)用于哺乳動物卵母細胞的激活中。離子霉素并不直接引起Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運,而是動員細胞內(nèi)的Ca2+,依次觸發(fā)Ca2+內(nèi)流。盡管離子霉素能激活受體卵母細胞,但只有與蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑6-DMAP和蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮協(xié)同作用,才可以有效地被激活；6-DMAP是蛋白磷酸化抑制劑,它能阻止蛋白質(zhì)的磷酸化進而抑制成熟促進因子和細胞靜止因子的活性。

電激活是應(yīng)用較為廣泛的一種激活卵母細胞的方式,其激活卵母細胞并不是因為電場本身激活了卵母細胞,而是電脈沖使卵母細胞膜的磷酸二酯雙分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性發(fā)生改變,細胞膜上形成很多可恢復(fù)的微小孔洞,使細胞外(介質(zhì))中Ca2+進入細胞,或通過激活I(lǐng)P3系統(tǒng)誘導(dǎo)細胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+,并使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高,從而引起卵母細胞的激活,電場強度和脈沖寬度是電激活的2個重要的參數(shù),與細胞膜上孔洞的形成有關(guān)。

4 小結(jié)

不斷地解決克隆技術(shù)在生產(chǎn)實踐中出現(xiàn)的問題 ,以期完善克隆技術(shù)理論體系、提高克隆效率、促進體細胞核移植為核心的克隆技術(shù)的轉(zhuǎn)基因動物研究的發(fā)展,運用克隆技術(shù)造福人類。

[1]Wilmut I,Schnieke A E,Mcwhir J,et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells[J].Nature,1997,385：810-813.

[2]Kato Y,Tani T,Sotomaru Y,et al.Eight calves cloned from somatic cells of single adult[J].Science,1998,282：2095-2098.

[3]Wa Ka Yama T,Yana Gimachi R.Cloning of male mice from adult tail-trip cells[J].Nature Genetics,1999,22：127-128.

[4]Ba Guisi A,Behboodi E,Mel Ican D T,et al.Production of goats by somatic cell nuclear transfer[J].Nat Biotechnol,1999,17(5)：456-461.

[5]Pol Ejaeva I A,Chen S H,Vau Ght T D,et al.Cloned pig s produced by nuclear transfer from adult somatic cells[J].Nature,2000,407：86-90.

[6]Chesne P,Adenot P G,Vigl Ietta C,et al.Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells[J].Nat Biotechnol,2002,20(4)：366-369.

[7]Shin T,K raemer D,Pryor J,et al.A cat cloned by nuclear transplantation[J].Nature,2002,415：859.

[8]Woods G L,White K L,Vanderwall D K,et al.A mule cloned from fetal cells by nuclear transfer[J].Science,2003,301：1063.

[9]Galli C,Lagutina I,Crotti G,et al.A cloned horse born to its dam twin[J].Nature,2003,424：635.

[10]Zhou Q,Renard J P,Friec G L,et al.Generation of fertile cloned rats by regulating oocy te activation[J].Science,2003,302：1179.

[11]Lee B C,Kim M K,Jang G,et al.Dog cloned form adult somatic cells[J].Nature,2005,436：641.

[12]Kato Y,T ani T,T sunoda Y.Cloning of calves from various somatic cell ty pes of male and female adult,newborn and fetal cows[J].J Reprod Fertil,2000,120：231-223.

[13]楊素芳,石德順,韓 杰,等.供體核種類對水牛核移植效果的影響[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2004,23(3)：233-237.

[14]Betts D H,Bo rdignon V,Hill J R,et al Reprogramming of telomerase activity and rebuilding of telomere length in cloned cattle[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(3)：1077-1082.

[15]Cibelli J B,Stice S L,Golueke P J,et al.Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts[J].Science,1998,289：1256-1258.

[16]Beyhan Z,Mitalipova M,Chang T C.First donor cell passage,starvation period and fusion-activation interval affect preimplantation development of bovine nuclear transfer embryos[J].T heriogenology,2002,57：396-402.

[17]Ono Y,Shimozawa N,Ito M,et al.Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer[J].Biology of Reproduction,2001,64：44-50.

[18]Kasinathan P,Knot t J G,M oreira P N,et al.Effect of fibroblast donor cell age and cell cycle on development of bovine nuclear transfer embryos in vitro[J].Biol Reprod,2001,64(5)：1487-1493.

[19]Arat S,Rzucidlo S J,Gibbons J,et al.Production of transgenic bovine embryos by transfer of transfected g ranulose cells into enucleated oocy tes[J].Mol Reprod Dev,2001,60(1)：20-26.

[20]嚴興榮,雷安民 .小鼠不同卵齡卵母細胞紡錘體位置及對去核率的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2005(5)：88.

[21]崔奎青,石德順,楊素芳.兔卵母細胞去核方法的研究[J].遺傳繁育,2005,32(7)：33.