李亮亮,杜 珊,劉 軍,趙曉鵝,馬保華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

克隆,即無(wú)性繁殖,是通過(guò)無(wú)性形式由單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生和親代非常相像的單個(gè)動(dòng)物后代。這里所說(shuō)的單個(gè)細(xì)胞從來(lái)源上既可以是體細(xì)胞,也可以是胚胎細(xì)胞；從年齡上看,既可以是成年細(xì)胞,也可以是幼年或胎兒細(xì)胞。在高等哺乳動(dòng)物中,細(xì)胞核移植技術(shù)是生產(chǎn)克隆動(dòng)物最為有效的克隆技術(shù),因此,動(dòng)物克隆技術(shù)實(shí)際上是指細(xì)胞核移植技術(shù)。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆是20世紀(jì)末生命科學(xué)領(lǐng)域最引人注目的高新技術(shù),已經(jīng)在畜牧業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥生產(chǎn)和疾病治療、生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究、野生珍貴瀕危動(dòng)物的保護(hù)以及轉(zhuǎn)基因工程等諸多領(lǐng)域蘊(yùn)藏巨大的潛力。通過(guò)科學(xué)研究者近十年的努力,哺乳動(dòng)物的克隆技術(shù)在農(nóng)業(yè)和生物制藥等方面取得了劃時(shí)代的進(jìn)步,展示了克隆技術(shù)的巨大應(yīng)用價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。

自1997年首次獲得體細(xì)胞克隆綿羊[1]以來(lái),已經(jīng)有牛[2]、小鼠[3]、山羊[4]、豬[5]、兔[6]、貓[7]、騾子[8]、馬[9]、大鼠[10]、狗[11]等多種克隆動(dòng)物相繼問(wèn)世,雖然動(dòng)物克隆已經(jīng)在多種動(dòng)物上取得成功,但是克隆技術(shù)目前仍存在一些問(wèn)題,如效率低、出生的動(dòng)物存在生理缺陷等多方面的問(wèn)題,積極尋求問(wèn)題的解決方法是關(guān)鍵所在。

哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)形成了一套比較完善的程序,主要包括：核受體胞質(zhì)的準(zhǔn)備、核供體細(xì)胞的選擇和處理、重構(gòu)胚的構(gòu)建、重構(gòu)胚激活、重構(gòu)胚的培養(yǎng)等。

1 供體細(xì)胞因素

1.1 供體細(xì)胞的類(lèi)型

自1997年Wilmut I等利用成年綿羊乳腺細(xì)胞克隆出綿羊“多莉”以來(lái),人們已分別利用不同的細(xì)胞克隆出山羊、豬、貓、兔、騾、馬、大鼠和狗等哺乳動(dòng)物。但是,不同的細(xì)胞類(lèi)型,對(duì)克隆的成功率影響很大。

Kato Y等[12]比較了牛同一個(gè)體卵母細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞及不同個(gè)體體細(xì)胞：肝細(xì)胞、耳細(xì)胞、子宮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞及卵母細(xì)胞對(duì)克隆效果的影響,結(jié)果認(rèn)為牛的卵丘/顆粒細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞最適合用于牛的核移植。楊素芳等[13]在水牛研究中采用成體成纖維細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞、胎兒皮膚細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞作為供體細(xì)胞來(lái)源用于核移植。結(jié)果顯示,來(lái)源于卵丘/顆粒細(xì)胞的重構(gòu)胚,其融合率、卵裂率和囊胚發(fā)育率都高于其他3類(lèi)細(xì)胞。卵丘/顆粒細(xì)胞適合作為供體細(xì)胞的可能原因：①卵丘細(xì)胞是自然靜止在G0/G1期的細(xì)胞；②卵丘細(xì)胞是包圍在卵母細(xì)胞周?chē)募?xì)胞,核移植后兩者胞質(zhì)更易互融；③卵丘細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性較高。染色體端粒的長(zhǎng)度在核移植胚胎的發(fā)育中可恢復(fù)到正常水平[14]。并且,卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞在激素水平上趨于一致,所處組織環(huán)境與子宮內(nèi)環(huán)境相似,利于重構(gòu)胚的發(fā)育生長(zhǎng)。

1.2 供體細(xì)胞周期

細(xì)胞周期對(duì)核移植成功率的影響至關(guān)重要?！岸嗬颉闭Q生以后,其研究者認(rèn)為[1],成功的關(guān)鍵因素之一是供體細(xì)胞經(jīng)血清饑餓后,處于G0期,認(rèn)為這種細(xì)胞易于重編程。但是,細(xì)胞同步化處理是否是克隆成功的必要條件,并無(wú)定論。Cibelli J B等[15]利用非靜止期細(xì)胞克隆出了轉(zhuǎn)基因牛。因此認(rèn)為,處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞群通過(guò)核移植仍具有支持分化細(xì)胞發(fā)育到正常個(gè)體的能力。Beyhan Z等[16]認(rèn)為,長(zhǎng)時(shí)間低血清濃度處理可能破壞核細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)構(gòu),影響移植成功率。目前,由于S期細(xì)胞處于DNA合成階段,重構(gòu)胚易形成2倍化和4倍化之間的非整倍體動(dòng)物,而沒(méi)有克隆個(gè)體的報(bào)道以外,其他G1、G2和M 期[17]的細(xì)胞都被證明可作為供體,用于克隆研究。

1.3 細(xì)胞傳代次數(shù)

細(xì)胞的傳代是否利于克隆個(gè)體方面的說(shuō)法不一。但是大多數(shù)研究者使用的是原代培養(yǎng)或短期培養(yǎng)的細(xì)胞,認(rèn)為這類(lèi)細(xì)胞利于核移植胚的發(fā)育。但 Kasinathan等[18]利用傳至18代細(xì)胞用于核移植,結(jié)果并未影響移植胚的發(fā)育潛能。Arat S等[19]的研究認(rèn)為,傳代培養(yǎng)15代的細(xì)胞核移植后,囊胚率高于培養(yǎng)10、11、13代的細(xì)胞。說(shuō)明培養(yǎng)代數(shù)高的細(xì)胞比代數(shù)低的細(xì)胞克隆效率高。究竟是什么機(jī)制控制這種高傳代數(shù)高移植效率的發(fā)育呢?目前尚無(wú)定論?？赡苁羌?xì)胞在傳代過(guò)程中,一些老化細(xì)胞,如染色體破壞嚴(yán)重,DNA結(jié)構(gòu)受損的細(xì)胞被淘汰。剩余的細(xì)胞具有比較完整的核酸結(jié)構(gòu),對(duì)外部環(huán)境有較強(qiáng)適應(yīng)性的細(xì)胞保留下來(lái),同時(shí)能適應(yīng)核移植過(guò)程中的一些機(jī)械損傷,最后與卵母細(xì)胞融合并發(fā)育成克隆個(gè)體。

2 受體細(xì)胞的因素

迄今已有3類(lèi)受體細(xì)胞用于核移植培育了后代 ,第1類(lèi)是去除原核的合子 ,但僅局限于用原核或假原核作為供體。第2類(lèi)是早期胚胎 ,但也只適合于用具有全能性的卵裂球作為供體。第3類(lèi)是卵母細(xì)胞,也是哺乳動(dòng)物核移植使用最多的一類(lèi)受體,這類(lèi)受體接受各階段胚胎的卵裂球,早期胎兒細(xì)胞、體細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞均獲得了后代。

受體細(xì)胞的去核是核移植中關(guān)鍵環(huán)節(jié),去核不完全將導(dǎo)致重構(gòu)胚的染色體倍性異常,進(jìn)而導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常。此外去核過(guò)程還會(huì)給卵母細(xì)胞帶來(lái)不同程度的物理和化學(xué)損害,因此不斷優(yōu)化去核方法和選擇適合于不同動(dòng)物的去核方法有助于提高克隆動(dòng)物的效率。目前,應(yīng)用比較廣泛的去核方法有盲吸去核法和化學(xué)誘導(dǎo)去核法。

2.1 盲吸去核法

通常,盲吸法去核的時(shí)間選擇在第一極體剛排出時(shí),因隨時(shí)間延長(zhǎng)卵細(xì)胞核遠(yuǎn)離第一極體,影響去核效率。嚴(yán)興榮報(bào)道[20],注射hCG 10 h后去小鼠卵核,去核率達(dá)90%以上；而12 h后去核,去核率下降22%。不同動(dòng)物的最佳去核時(shí)間不同,牛卵母細(xì)胞一般為體外成熟18～20 h后,而豬卵母細(xì)胞則在體外成熟44～48 h后為宜。此外,不同動(dòng)物卵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同,其盲吸法的去核效率也不同。崔奎青[21]利用兔卵母細(xì)胞在相差顯微鏡下觀察到染色體的特點(diǎn),將盲吸法與spingdle view系統(tǒng)結(jié)合,去核率達(dá)98.4%,且損失的胞質(zhì)少；因小鼠卵母細(xì)胞抗機(jī)械損傷能力差,去核后卵母細(xì)胞成活率低,小鼠卵母細(xì)胞法借助Piez系統(tǒng),去核率高達(dá)99%,且成活率也達(dá)95%,這種方法對(duì)那些抗損傷能力差的動(dòng)物卵母細(xì)胞不失為一種有效的替代盲吸法的機(jī)械去核法。

盲吸去核法雖然存在這樣一些不足,但其操作簡(jiǎn)捷、迅速,仍是目前哺乳動(dòng)物克隆普遍采用的方法。該法的不足在于造成胞質(zhì)流失和一些重要因子的丟失,從而影響到核的重編程和重構(gòu)胚的后續(xù)發(fā)育,此外還給卵母細(xì)胞帶來(lái)機(jī)械損傷。

2.2 化學(xué)誘導(dǎo)去核法

其機(jī)理是在極體排出階段,采用干擾染色體分離或紡錘體功能的化學(xué)試劑,使所有染色體與紡錘體牢固結(jié)合,同時(shí)蛋白合成抑制劑抑制細(xì)胞周期蛋白B合成,降低促成熟因子濃度,極體借助于慣性將染色質(zhì)和紡錘體帶出胞外,達(dá)到去核的目的。脫羰秋水仙堿(demecolcine,DC)是目前最常用的化學(xué)誘導(dǎo)去核劑。與盲吸法等建立在顯微操作系統(tǒng)基礎(chǔ)之上的機(jī)械去核法相比,化學(xué)去核法程序簡(jiǎn)單、機(jī)械損傷小、胞質(zhì)丟失少、重復(fù)性好、適合大規(guī)模卵母細(xì)胞去核,具有很樂(lè)觀的應(yīng)用前景。

3 重構(gòu)胚激活因素

重構(gòu)胚的激活是體細(xì)胞克隆技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),體細(xì)胞克隆胚胎的充分激活是保證胚胎正常發(fā)育的先決條件,只有在去核卵母細(xì)胞充分激活的情況下才可以指導(dǎo)移入的核發(fā)生重編程(reprogramming)。目前,動(dòng)物細(xì)胞核移植的總效率很低,這可能與卵母細(xì)胞未被充分激活有關(guān)。由于化學(xué)激活方法能大大提高體細(xì)胞克隆胚胎的激活效率,許多研究者使用重復(fù)性好、結(jié)果較穩(wěn)定的化學(xué)方法來(lái)激活卵母細(xì)胞,近年來(lái)已成為小鼠、牛、豬、山羊等體細(xì)胞克隆成功的重要原因。在此基礎(chǔ)上,科學(xué)家們經(jīng)過(guò)不斷的努力,核移植的成功率不斷提高。

常用的重構(gòu)胚的激活物質(zhì)有乙醇、氯化鍶、放線(xiàn)菌酮、離子霉素和6-DMAP。另外還有電激活法。乙醇是發(fā)現(xiàn)較早的一種化學(xué)激活劑,其對(duì)卵母細(xì)胞的激活主要是通過(guò)水解細(xì)胞膜上 4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)產(chǎn)生1,4,5-三磷酸肌醇(IP3),從而誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)源鈣釋放到細(xì)胞質(zhì),提高細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度。盡管乙醇對(duì)克隆胚的激活無(wú)種間特異性,但不同動(dòng)物克隆胚對(duì)乙醇激活的反應(yīng)不同。關(guān)于氯化鍶(SrCl2)引起激活的機(jī)制,有人認(rèn)為Sr2+作為與Ca2+同族的二價(jià)陽(yáng)離子,可能是通過(guò)細(xì)胞膜上的Ca2+離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),并進(jìn)入鈣庫(kù)(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體等),置換出內(nèi)源鈣,釋放入胞質(zhì)中,引起Ca2+離子波動(dòng),導(dǎo)致卵母細(xì)胞的激活。放線(xiàn)菌酮是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑,通過(guò)作用80 S核糖體抑制肽鏈的移動(dòng),從而抑制蛋白質(zhì)的合成；單獨(dú)的放線(xiàn)菌酮不能使豬體外成熟卵母細(xì)胞激活,其機(jī)制尚不清楚,可能是豬卵母細(xì)胞對(duì)其不敏感,只有與其他刺激因素聯(lián)合使用時(shí),才起到協(xié)同促進(jìn)的作用,這也說(shuō)明,放線(xiàn)菌酮引起的卵母細(xì)胞激活不是通過(guò)Ca2+被動(dòng)起作用的,而是通過(guò)抑制有關(guān)蛋白質(zhì)的合成起作用。SrCl2與放線(xiàn)菌酮聯(lián)合使用對(duì)豬卵母細(xì)胞的激活有協(xié)同促進(jìn)作用。離子霉素是一種近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的高效Ca2+載體,也是一種有效的人工激活劑,已被人們廣泛地應(yīng)用于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的激活中。離子霉素并不直接引起Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),而是動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)的Ca2+,依次觸發(fā)Ca2+內(nèi)流。盡管離子霉素能激活受體卵母細(xì)胞,但只有與蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑6-DMAP和蛋白質(zhì)合成抑制劑放線(xiàn)菌酮協(xié)同作用,才可以有效地被激活；6-DMAP是蛋白磷酸化抑制劑,它能阻止蛋白質(zhì)的磷酸化進(jìn)而抑制成熟促進(jìn)因子和細(xì)胞靜止因子的活性。

電激活是應(yīng)用較為廣泛的一種激活卵母細(xì)胞的方式,其激活卵母細(xì)胞并不是因?yàn)殡妶?chǎng)本身激活了卵母細(xì)胞,而是電脈沖使卵母細(xì)胞膜的磷酸二酯雙分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性發(fā)生改變,細(xì)胞膜上形成很多可恢復(fù)的微小孔洞,使細(xì)胞外(介質(zhì))中Ca2+進(jìn)入細(xì)胞,或通過(guò)激活I(lǐng)P3系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放Ca2+,并使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高,從而引起卵母細(xì)胞的激活,電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖寬度是電激活的2個(gè)重要的參數(shù),與細(xì)胞膜上孔洞的形成有關(guān)。

4 小結(jié)

不斷地解決克隆技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中出現(xiàn)的問(wèn)題 ,以期完善克隆技術(shù)理論體系、提高克隆效率、促進(jìn)體細(xì)胞核移植為核心的克隆技術(shù)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的發(fā)展,運(yùn)用克隆技術(shù)造福人類(lèi)。

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