趙 鑫,胡高博,卞江濤,盧全晟,宋彥軍,薛 利,王國(guó)旗,張居農(nóng)

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 832000;2.北京合眾牧豐科技有限公司,北京 100057)

母牛的卵巢在出生時(shí)含有20萬(wàn)～40萬(wàn)個(gè)卵母細(xì)胞,但在其生命過程中有99%的原始卵泡閉鎖,僅有1%的可以發(fā)育成熟而排卵[1]。應(yīng)用超數(shù)排卵技術(shù)可使每次排卵由1～3個(gè)增至10～20個(gè),而通過重復(fù)超排,可充分發(fā)揮良種奶牛的繁殖潛力,對(duì)育種和快速擴(kuò)群具有特別重大的意義。郭志勤等(2001)[2]、張居農(nóng)等(2005)[3]、呼格吉勒?qǐng)D(2003)[4]、付靜濤等(2002)[5]、盧全晟等(2003、2005)[6,8]、馬學(xué)海(2007)[7]、陳靜波(1992)[9]的研究報(bào)道認(rèn)為,采用外源激素重復(fù)超排,以非手術(shù)沖胚對(duì)中國(guó)荷斯坦牛、安格斯牛、海福特牛和娟姍母牛的內(nèi)分泌及生殖道的刺激影響較小,可多次進(jìn)行重復(fù)超排處理。為探討重復(fù)超排在西門塔爾母牛中應(yīng)用的效果及影響因素,本研究在北京日升德龍奶牛養(yǎng)殖公司牛場(chǎng)進(jìn)行了試驗(yàn),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 供體母牛 本試驗(yàn)選擇6頭年齡4～9歲,健康,有正常的發(fā)情周期,無(wú)繁殖機(jī)能疾病,膘情中上等的西門塔爾經(jīng)產(chǎn)母牛。母牛分娩60 d以上,斷乳,無(wú)流產(chǎn)史,性情溫順。直腸檢查卵巢機(jī)能正常,子宮頸無(wú)明顯彎曲,子宮角對(duì)稱。

供試母牛在開放式圈舍按奶牛的飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)飼喂,計(jì)算機(jī)控制精確給料,自由飲水。供體牛按飼養(yǎng)管理程序正常飼養(yǎng),定時(shí)飼喂、擠奶,自由運(yùn)動(dòng),每天 3次飼喂,保證充足的微量元素,一次注射維生素A、D、E。

母牛在超排前2個(gè)月進(jìn)入固定胚胎采集與移植場(chǎng)地,單獨(dú)組群、編號(hào),保持飼養(yǎng)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。試驗(yàn)地為北京日升德龍奶牛養(yǎng)殖公司牛場(chǎng)。

1.2 供試藥物與儀器設(shè)備 FSH:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所純化凍干產(chǎn)品(7.0～7.5 mg/瓶);FSH(Foiltropin):加拿大Vetrepharm Cananda lnc生產(chǎn);EAZIBREEDCIDR(1.9 g Progesterone):PfizerPty.Iimited生產(chǎn);氯前列烯醇(PG,0.2mg):上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所生產(chǎn);促排卵素3號(hào)(LHRH-A3):寧波激素制品有限公司生產(chǎn);2%利多卡因:泅水希爾康制藥有限公司生產(chǎn);移植槍、塑料硬外套、無(wú)菌軟外套:法國(guó)卡蘇公司生產(chǎn);實(shí)體顯微鏡:日本Olympus公司;CL5500胚胎冷凍儀:澳大利亞Cytologic公司生產(chǎn);Millipore超純水儀:英國(guó)Whattman公司生產(chǎn);0.5～10 jxL微量計(jì)量器:美國(guó)Gilson公司生產(chǎn);10～18Fr沖卵管:日本富士平公司生產(chǎn);35～60塑料培養(yǎng)皿:瑞士Nunc公司生產(chǎn);集卵杯(側(cè)漏式):日本富士平公司生產(chǎn);集卵杯(側(cè)漏式):法國(guó)卡蘇公司生產(chǎn)。試驗(yàn)用無(wú)機(jī)鹽試劑除特別說明外,均購(gòu)自Sigma公司。

1.3 母牛超排處理方案 本試驗(yàn)采用FSH逐次遞減法進(jìn)行超排處理。首先檢查供體牛子宮及卵巢的狀態(tài),然后按表1的方案進(jìn)行同期發(fā)情與超數(shù)排卵進(jìn)行處理。

在供體牛發(fā)情周期任意一天給供體牛埋植CIDR,以埋植CIDR當(dāng)天為0 d;第5天開始注射FSH,連續(xù)4 d減量注射;第7天下午和第8天上午分別注射PG 2支;第8天下午撤栓,同時(shí)觀察發(fā)情。在供體牛接受爬跨后第1次輸精,之后約隔12 h第2次輸精,輸精劑量比正常人工授精多1倍。試驗(yàn)組牛在第1次輸精。以發(fā)情日計(jì)為0 d,在第17天采用非手術(shù)法采卵。1個(gè)情期后 ,再按上述步驟再次超排同批西門塔爾母牛,對(duì)比2次超排的結(jié)果。

表1 母牛超排處理方案

1.4 沖胚 本試驗(yàn)采用2種沖胚方法。第1種方法為注射式?jīng)_胚,第2種為硬膜外腔麻醉的滴注式?jīng)_胚法,操作過程按盧全晟等(2003)[8]方法進(jìn)行。

1.5 胚胎的采集與鑒定 在供體牛發(fā)情配種后的第7天,用采卵管非手術(shù)采卵,在連續(xù)變倍體視鏡下,按形態(tài)鑒定標(biāo)準(zhǔn)分為A、B、C三個(gè)等級(jí)。其中只有A、B級(jí)可以冷凍保存,C級(jí)胚胎一般用胚胎移植槍移植給受體母牛。A級(jí)胚胎形態(tài)典型,卵細(xì)胞和分裂球的輪廓清晰,細(xì)胞質(zhì)致密,色調(diào)和分布極均一。B級(jí)胚胎與典型的胚胎相比,稍有變形,但卵細(xì)胞和分裂球的輪廓清晰,細(xì)胞質(zhì)致密,分布均一,變性細(xì)胞和水疤不超過10%～30%。C級(jí)胚胎形態(tài)有明顯變異,卵細(xì)胞和分裂球輪廓稍不清晰或部分不清晰,細(xì)胞質(zhì)不致密,分布不均勻,色調(diào)突起的水泡和變性細(xì)胞占30%～50%。

本試驗(yàn)中的可用胚胎指的是A級(jí)和B級(jí)2個(gè)等級(jí)的胚胎。

1.6 數(shù)據(jù)處理 分別統(tǒng)計(jì)分析連續(xù)超排對(duì)母牛回收卵、可用胚胎、退化胚胎和未受精比率,統(tǒng)計(jì)結(jié)果用方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 第1次超排結(jié)果與分析 由表2可見,4～7歲母牛(07106、07112、07136、07140、07142)超排獲得的胚胎數(shù)個(gè)體間差異不顯著(P＞0.05);而4～7歲母牛與9歲母牛(07119)超排獲得的胚胎數(shù)比較,差異顯著(P＜0.05)。

表2 西門塔爾母牛第1次超排結(jié)果 枚

2.2 第2次超排結(jié)果與分析 間隔30 d,采用同樣的超排處理方案,對(duì)6頭西門塔爾母牛進(jìn)行了第2次超排處理,結(jié)果列于表3。2次超排結(jié)果比較見表4。由表4可知耳號(hào)為07136和07142牛2次超排胚胎可用率差異顯著(P＜0.05),其余 4頭(07106、07112、07119、07140)與第 1次超排結(jié)果差異不顯著(P＞0.05);而在退化胚胎率和未受精率方面,兩次超排的結(jié)果差異顯著(P＜0.05)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),西門塔爾母牛反復(fù)超排,對(duì)胚胎可用率沒有顯著影響或者影響比較小(表4),但第2次超排后胚胎退化率明顯增加,未受精率也升高(P＜0.01)。

本試驗(yàn)還注意到,重復(fù)超排后獲胚總數(shù)略有下降(P＞0.05),說明超排對(duì)西門塔爾母牛有一定的影響,造成這種現(xiàn)象的原因可能是:第1次超排后母牛的卵巢增大,黃體過多,雖然經(jīng)過一個(gè)情期短時(shí)間的恢復(fù),仍然有部分母牛的卵巢沒有完全恢復(fù)好。而且同一個(gè)體在不同時(shí)間對(duì)藥品反應(yīng)也會(huì)有一定差別,經(jīng)過重復(fù)超排,母牛對(duì)藥品的敏感度也會(huì)降低。

表3 西門塔爾母牛第2次超排結(jié)果 枚

2.3 提高西門塔爾牛超數(shù)排卵率相關(guān)因素的探討營(yíng)養(yǎng)狀況是影響供體母牛超數(shù)排卵的重要因素之一。郭志勤等(2001)[2]認(rèn)為,中等膘情的供體牛超數(shù)排卵處理后可獲得理想的排卵數(shù),優(yōu)于其它膘情的牛。本試驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。

本試驗(yàn)采用綜合措施以提高采胚率和可用胚率,盡量避免應(yīng)激因素對(duì)反復(fù)超排結(jié)果的影響,收到較好的效果。如加強(qiáng)輸精操作,輸精時(shí)使用細(xì)且精致的輸精器外鞘,減少子宮損傷;由輸精操作熟練的技術(shù)人員輸精;最后一次輸精后8～12 h用青霉素160萬(wàn)u、鏈霉素100萬(wàn)u溶液清宮等,這與何光中等(2003)[10]、王洪寶等(2003)[11]、吳亦芳等(2004)[12]、劉俊平等(2008)[13]、李樹靜等(2001)[14]應(yīng)用此技術(shù)得到的效果是一致的。

表4 西門塔爾母牛2次超排結(jié)果比較 %

超排處理本身對(duì)母牛是一次應(yīng)激,而重復(fù)超排的母牛必須要有一個(gè)時(shí)期恢復(fù),這個(gè)時(shí)間以50～60 d為宜。重復(fù)超排間隔時(shí)間短,供體的生殖系統(tǒng)與激素調(diào)節(jié)不能完全恢復(fù),重復(fù)超排效果不穩(wěn)定;間隔時(shí)間長(zhǎng),則影響到母牛的利用率。

本試驗(yàn)間隔30 d后對(duì)西門塔爾母牛進(jìn)行重復(fù)超排,獲得一定的效果。限于條件,本研究?jī)H對(duì)同一供體母牛進(jìn)行了2次的重復(fù)超排,而連續(xù)多次重復(fù)超排的最佳時(shí)間間隔、激素處理方案等還有待于進(jìn)一步探討。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在間隔30 d對(duì)6頭4～9歲的西門塔爾母牛進(jìn)行重復(fù)超排,第1次超排獲得胚胎73枚,可用胚胎49枚;第2次超排獲得胚胎69枚,可用胚胎45枚。母牛經(jīng)過一個(gè)情期的生殖與體況的恢復(fù),其卵巢機(jī)能恢復(fù)到超排前的狀態(tài),采用重復(fù)超排,生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)胚胎,可以提高優(yōu)秀母牛胚胎的生產(chǎn)數(shù)量。

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