余 剛

(西寧市畜牧獸醫(yī)站,青海 810003)

脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding protein,FABPs)家族是由一些小的、存在于細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組成,在機體中參與細胞內(nèi)脂肪酸的攝取,并能協(xié)助將動物組織細胞內(nèi)的脂肪酸從胞膜處運至其進行β-氧化的場所或甘油三酯和磷酯合成部位,促進心肌和脂肪細胞中甘油三酯的沉積,對體脂的沉積及動員等具有重要調(diào)控作用[1-3]。Huang等[4]研究發(fā)現(xiàn),30～90日齡的公哈薩克綿羊肌肉組織中H-FABP的表達水平與肌間脂肪(intramuscular fat,IMF)含量呈極顯著的強正相關(guān)。目前普遍認為FABP是影響肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因,在肉質(zhì)性狀的形成中具有重要的生物學功能,因此將H-FABP基因作為候選基因來研究其與動物生產(chǎn)性狀的關(guān)系,對動物分子育種和標記輔助選擇具有一定的理論意義和實際應(yīng)用價值。

陜北白絨山羊為著名的絨肉兼用型培育山羊品種,除產(chǎn)絨性能優(yōu)良外還具有肉質(zhì)細嫩、肉中膽固醇含量少、膻味輕等特點,但由于體型稍小,其產(chǎn)肉性能有待提高。本研究通過分析陜北白絨山羊H-FABP基因的SNPs及其對生長和胴體性狀的影響,探討陜北白絨山羊群體的遺傳特性,為陜北白絨山羊的選育提高和分子標記輔助選擇等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血樣采集及基因組DNA的提取 從陜西省橫山縣狄青原陜北白絨山羊原種場隨機抽取原種周歲陜北白絨山羊253只,頸靜脈采血,ACD抗凝,并參照文獻[5]的方法,提取血液基因組DNA。

1.2 胴體和體尺指標測定 周歲陜北白絨山羊眼肌面積和背膘厚的測定參考Silva等[6]的方法,應(yīng)用加拿大AMI-900型便攜式獸用B超儀測定。實驗羊體重及主要體尺指標參考張沅等[7]的方法,由同一人實地測量,并記錄被測個體的出生重和5月齡斷奶重。

1.3 引物設(shè)計與PCR反應(yīng)擴增 參照綿羊 HFABP基因的序列(ACCESSION AY157617)設(shè)計引物,序列如下:

Forward:5'-AGCCTTCGT TTCATCCTC-3'

Reverse:5'-AGCAAGTAT TTGGTCCTGT-3'

由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系25 μ L:Taq DNA Polymerase(MBI產(chǎn),0.5 u/μ L)2.0 μ L,2.5 mmol/L MgCl22.0 μ L,10 ×Buffer 2.5 μ L,2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μ L,50 ～ 100 ng 模板 DNA,10 pmol/μ L 上下游引物各 0.4 μ L,加水至25 μ L。PCR反應(yīng)程序:95℃5 min;94℃40 s,48.9℃50 s,72℃1 min,共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 擴增產(chǎn)物的SSCP分析 利用垂直凝膠電泳法進行PCR-SSCP分析。將5 μ L的 PCR產(chǎn)物加入5 μ L的上樣緩沖液(Loading Buffer)中 98℃變性 10 min,立即冰浴10 min后點樣于預(yù)冷的10%聚丙烯酰胺凝膠中,以5 V/cm電壓于20℃的1×TBE電泳液中電泳12～14 h,最后銀染照相。

1.5 擴增產(chǎn)物的回收測序 經(jīng)SSCP分析后不同基因型的PCR擴增產(chǎn)物用柱式膠回收試劑盒(購自杭州博日科技有限公司)回收純化,回收后的DNA片段送交上海捷瑞生物工程有限公司進行正反雙向測序。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 對該位點基因型的分布進行Hardy-Weinberg平衡的卡方適合性檢驗,依據(jù)最小二乘分析原理,用SAS統(tǒng)計軟件的一般線性模型GLM程序?qū)θ后w H-FABP基因型效應(yīng)進行分析,采用Duncan氏法進行多重比較。依據(jù)影響生長和胴體性狀的因素,并考慮本實驗的實際情況(所有參試周歲羊均采用半舍飼半放牧的飼養(yǎng)管理方式并在相同條件下飼養(yǎng)),引入下列參數(shù)并建立以下模型:

Yij=μ+Gi+Sj+Gi×Sj+Eij

式中Yij為性狀表型值,μ為群體平均值,Gi為基因型效應(yīng),Sj為性別效應(yīng),Gi×Sj是基因型與性別之間的互作效應(yīng),Eij為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波測定 本實驗所得到的超聲波掃描切面影像圖的灰度、對比度、增益度等較適宜,圖像清晰,且測量部位受體位變化影響小,代表性強,易于定位和操作,故根據(jù)所測超聲波影像計算的背膘厚度和眼肌面積接近真值。

2.2 PCR擴增 擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增片段與目的片段大小一致(526 bp),且目的條帶清晰、特異性好,可直接用于SSCP分析(圖1)。

圖1 陜北白絨山羊H-FABP基因PCR產(chǎn)物

圖2 陜北白絨山羊H-FABP基因SSCP電泳結(jié)果

圖3 陜北白絨山羊H-FABP基因2種基因型序列分析

2.3 SSCP分析 對擴增產(chǎn)物進行SSCP檢測,發(fā)現(xiàn)有一對等位基因“A和B”以及兩種基因型“AA、AB”,尚未檢測到BB型個體,如圖2所示。

2.4 不同基因型個體的測序 以SSCP檢測的2種基因型AA、AB型為樣本,分別測序(如圖3)。通過比對發(fā)現(xiàn)在H-FABP基因位點存在一處突變,為G→C,因該位點位于內(nèi)含子區(qū),故不引起氨基酸序列改變。

2.5 H-FABP基因多態(tài)位點的遺傳分析 由表1可以看出,在所研究的群體中,AA型為優(yōu)勢基因型,A等位基因在群體中為優(yōu)勢基因,B等位基因頻率較低,兩者差異顯著(P＜0.05),群體處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)。

表1 陜北白絨山羊H-FABP基因SSCP的基因頻率和基因型頻率

由表2可看出,其PIC值為0.084 4＜0.25可知,說明該位點為低度多態(tài)性,表明該基因此位點多態(tài)性較差。

表2 陜北白絨山羊H-FABP基因多態(tài)性分析

2.6 H-FABP基因的SNPs與生長發(fā)育及胴體性狀的相關(guān)分析 運用兩因素互作模型,對253只周歲陜北白絨山羊不同基因型個體生長及胴體性狀進行了差異顯著性檢驗。結(jié)果表明(表3),AA型和AB型之間在陜北白絨山羊的胸圍和體高上差異顯著(P＜0.05);在其他性狀上,2種基因型間均差異不顯著(P＞0.05);除在體斜長和背膘厚上表現(xiàn)AB＞AA,在其他性狀上均表現(xiàn)AA＞AB,純合基因型個體各性狀的表型值相對較高。本實驗還發(fā)現(xiàn),性別對除出生重、體長、眼肌面積和背膘厚外的其他指標均無顯著影響,互作效應(yīng)除背膘厚外差異均不顯著。

表3 H-FABP基因位點不同基因型對陜北白絨山羊生長及胴體性狀的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 H-FABP基因第3內(nèi)含子多態(tài)性分析 本實驗對H-FABP基因第3內(nèi)含子的多態(tài)性進行分析發(fā)現(xiàn),周歲陜北白絨山羊群體在H-FABP基因第3內(nèi)含子座位上存在1對等位基因,其中A等位基因為優(yōu)勢基因;該群體在該位點處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài),即該群體在人工選擇、遷徙和遺傳漂變等因素作用下,該基因座處于非平衡狀態(tài)中;該群體在該位點的遺傳多態(tài)性處于低度多態(tài)水平(其PIC＜0.25)。造成上述情況的原因,可能主要與該群體在長期而系統(tǒng)的閉鎖繁育中,受高強度的人工選擇導致其高度近交,造成部分等位基因流失有關(guān)。

3.2 H-FABP基因多態(tài)性與生長及胴體性狀關(guān)系的分析 有關(guān)H-FABP基因與動物生產(chǎn)性狀之間關(guān)系的研究,在國內(nèi)外已有大量報道。Brockmann等[8]研究認為豬第4號染色體上存在影響脂肪沉積(包括背膘厚和腹脂)以及生長速度的QTL;而H-F ABP基因恰好位于豬4號染色體上,且它本身又在脂肪細胞中表達并影響甘油三酯的生成與分解[9]。Calvo等[10]采用基因組步移技術(shù)對綿羊H-FABP基因進行了克隆并將其定位于2號染色體遺傳標記CSRD 2115與BM 2113之間,在對4個綿羊品種(Ovis aries)和歐洲摩弗倫(Mouflon)羊的H-FABP基因外顯子2和內(nèi)含子3的研究中各發(fā)現(xiàn)1個SNPs位點。本研究結(jié)果新發(fā)現(xiàn)陜北白絨山羊H-FABP基因在內(nèi)含子3內(nèi)存在G→C的突變,盡管該突變未引起氨基酸的改變,但這可能是造成了2種基因型的陜北白絨山羊在部分生長及胴體性狀上存在差異的原因。從本研究結(jié)果來看,HFABP基因AA型和AB型之間在陜北白絨山羊的胸圍和體高上差異顯著(P＜0.05),且除在體斜長和背膘厚上表現(xiàn)AB＞AA外,在其他性狀上均表現(xiàn)AA＞AB,這說明H-FABP基因與絨山羊生長發(fā)育及胴體性狀相關(guān),AA型個體為有利基因型,這可能與AA型個體的H-FABP具有較高的利用脂肪的能力有關(guān),還可能是因為本實驗樣本數(shù)有限以及AB型個體樣本數(shù)太少所致。H-FABP基因內(nèi)含子區(qū)的變異可能影響到H-FABP的活性及基因表達,調(diào)控機體脂肪代謝,進而影響動物生長發(fā)育及胴體性狀,因此H-FABP可能是影響絨山羊脂肪代謝等的主效基因或與主效基因相連鎖,并且可能是通過MAS(標記輔助選擇)進行部分生長發(fā)育性狀等改良的理想基因。本研究結(jié)果還顯示 ,通過提高AA型的頻率可望增加絨山羊的胸圍和體高且可能改善絨山羊的生長發(fā)育及胴體性狀,不過,這需在更多群體中檢驗G→C突變位點能否用于山羊相關(guān)性狀等的分子標記輔助選擇。本文僅初步分析了不同H-FABP基因型與陜北白絨山羊相關(guān)性狀的關(guān)系,H-FABP基因是否確實影響絨山羊的生長發(fā)育及胴體性狀,是否與山羊肉IMF含量、嫩度、風味等肉質(zhì)性狀相關(guān),還有待進一步研究。

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