王 輝，侯 瑞，楊 光，徐文林，呂 申

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 超聲科，遼寧 大連116011；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116027)

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為BRAF基因可能是一種癌基因，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前國(guó)內(nèi)外，BRAF蛋白在結(jié)直腸癌組織、惡性黑色素瘤及甲狀腺腫瘤中表達(dá)的研究較多，但還未見(jiàn)到在前列腺內(nèi)的表達(dá)的研究。本研究旨在探討B(tài)RAF在前列腺癌組織中表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 分 組

病例為2005～2009年大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行經(jīng)直腸彩超檢查的患者，前列腺癌及增生患者均行經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)下前列腺穿刺活檢確診。

前列腺癌組：74例，均為腺癌?；颊吣挲g34～92歲，平均年齡(58.00±13.51)歲。所有病例都行螺旋CT或核磁共振檢查及全身骨組織核素掃描，判斷周圍浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移情況，有無(wú)骨轉(zhuǎn)移。標(biāo)本均按2002年WHO腫瘤國(guó)際組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)[1]分類：其中中高分化癌23例，低分化癌51例；按Whitmore-Jewett(ABCD)系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期[2]：其中A期+B期40例,C期+D期34例，本實(shí)驗(yàn)將(A+B)期作為未浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移組，(C+D)期作為浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移組。

良性增生組：39例，患者年齡40～87歲，平均年齡(62.34±14.37)歲。

1.2 方 法

以上所有病例術(shù)前均未行任何內(nèi)分泌治療及放化療。將所收集穿刺活檢標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，用點(diǎn)陣法石蠟包埋，每個(gè)蠟塊內(nèi)含25～35條穿刺活檢組織。采取連續(xù)切片，片厚3 μm。石蠟切片置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，62℃下3 h，放置待用。

免疫組化方法：BRAF單克隆抗體(濃度分別為1∶20,1∶1∶100，1∶500),二抗為羊抗鼠IgG(1∶120),以上抗體及SP試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司。具體按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,以0.01 mol/L、pH 7.4 PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 BRAF免疫組化染色結(jié)果判斷

BRAF染色以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。選取有代表性的腺上皮區(qū)域，在400倍高倍鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，即分別對(duì)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞著色程度進(jìn)行分級(jí)記分,結(jié)果以兩項(xiàng)乘積表示。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：0分為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，1分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～50%，3分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%～75%，4分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>75%。染色強(qiáng)度：0分為無(wú)染色，1分為淡棕黃色，2分為棕黃色，3分為深褐色。兩者相乘1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為中等陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 10.0處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 前列腺癌與增生組織BRAF蛋白表達(dá)特點(diǎn)

前列腺癌與增生組織BRAF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為64.86%，10.26%，兩者比較差異有顯著性意義，P<0.05。見(jiàn)表1、圖1、2。

表1 前列腺癌與增生組織BRAF蛋白表達(dá)Tab 1 The expression of BRAF in cases of prostate cancer and BPH

1)與增生組比較，P<0.05

圖1 前列腺癌BRAF蛋白陽(yáng)性表達(dá)(SP ×100)Fig 1 The expression of BRAF in cases of prostate cancer(+) (SP ×100)

圖2 良性增生BRAF蛋白陽(yáng)性表達(dá)(SP ×200)Fig 2 The expression of BRAF in cases of BPH(+) (SP ×200)

2.2 前列腺癌BRAF蛋白的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

如表2所示，中高分化前列腺癌與低分化前列腺癌Braf蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為43.48%、74.51%(P<0.05)。(A+B)期前列腺癌與(C+D)期前列腺癌Braf蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為42.50%、91.18%(P<0.05)?！?0歲前列腺癌病例與>60歲病例Braf蛋白表達(dá)陽(yáng)性率差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。

表2 前列腺癌組織BRAF蛋白表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

1)與低分化組比較，P<0.05；2)與(C+D)期比較，P<0.05

3 討 論

BRAF基因是1988年由Ikawa[3]等首先在人類尤文氏肉瘤中發(fā)現(xiàn)并克隆確認(rèn)的，是一個(gè)能轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞且有活性的DNA序列，因其與CRAF和ARAF具有相當(dāng)高的同源性，故稱其為BRAF。英國(guó)腫瘤基因組計(jì)劃的科學(xué)家Davies等[4]對(duì)來(lái)自于530個(gè)不同腫瘤細(xì)胞株的基因組DNA進(jìn)行篩查，結(jié)果證實(shí)有43株細(xì)胞發(fā)生了BRAF基因突變。BRAF突變后持續(xù)性激活MAPK通路,使前有絲分裂原有效分裂能力增強(qiáng),導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和分化。調(diào)查顯示,大約有65%的結(jié)直腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤與該家族中的BRAF突變體有關(guān)。研究表明，BRAF 基因突變?cè)诩谞钕倌[瘤發(fā)生發(fā)展中有其獨(dú)特而重要的作用[3-7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，BRAF蛋白高表達(dá)在前列腺癌的發(fā)生中起到重要的作用。前列腺癌BRAF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為64.86%，增生組陽(yáng)性率為10.26%。前列腺癌組較增生組BRAF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著增高，P<0.05。

Yuen ST、張艷霞等[8,9]已證實(shí)BRAF蛋白在高、中、低分化結(jié)直腸癌中的表達(dá)陽(yáng)性率差異有顯著性意義，且BRAF在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的表達(dá)模式符合“增生性息肉-鋸齒狀腺瘤-癌”遞增趨勢(shì)。Houben、朱琰琰等[10,11]的研究還發(fā)現(xiàn)，BRAF的突變狀態(tài)與惡性黑色素瘤的分期、預(yù)后有關(guān)，存在BRAF突變者預(yù)后不良的現(xiàn)象。

本研究結(jié)果顯示，中高分化病例BRAF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為43.48%，低分化病例蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為74.51%。二者差異有顯著性意義，P<0.05。(A+B)期(無(wú)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移)病例BRAF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為42.50%，(C+D)期(有浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移)病例蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為91.18%。二者差異有顯著性意義，P<0.05。說(shuō)明BRAF蛋白表達(dá)與前列腺癌的組織分化及臨床分期有密切關(guān)系。這與其在其他腫瘤內(nèi)的表達(dá)規(guī)律基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，BRAF蛋白表達(dá)與前列腺癌患者年齡大小無(wú)關(guān)。

因此，BRAF蛋白的表達(dá)與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。檢測(cè)BRAF蛋白表達(dá)可能會(huì)比較好地協(xié)助前列腺癌診斷分型、判斷預(yù)后。

[1] 何祖根,鄭閃,林冬梅.前列腺癌組織學(xué)分類[J].診斷病理學(xué)雜志,2003,10(5):316-319.

[2] 張玉海,邵強(qiáng).前列腺外科[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001,346-347.

[3] Ikawa S,Fukui M,Ueyama Y,et al.B-raf,a new memberof the raf family is activated by DNA rearrangement[J].Mol Cell Biol,1988,8(6):2651- 2654.

[4] Davies H,Bignell GR,Cox C,et al.Mutations of the BRAF gene in human cancer[J].Nature,2002,417:949-954.

[5] 羅書(shū)畫(huà)，周揚(yáng)，龔日祥，等.BRAF基因與甲狀腺癌[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2007(1):64-66.

[6] Mitsutake N,Knauf JA,Mitsutake S,et al.ConditionalBRAFV600E expression induces DNA synthesis,apoptosis,dedifferentiation,and chromosomal instability in thyroid PCCL3 cells[J].Cancer Res,2005,65(6):2465-2473.

[7] Knauf JA,Ma X,Smith EP,et al.Targeted expression ofBRAFV600E in thyroid cells of transgenic mice results inpapillary thyroid cancers that undergo dedifferentiation[J].Cancer Res,2005,65(10):4238- 4245.

[8] Yuen ST,davies H,Chan TL,et al.Similarity of the phenotypicpatterns associated with BRAF and KRAS mutations in colorectal neoclassic[J].Cancer Res,2004,62(22):6451-6455.

[9] 張艷霞.BRAF在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(9):798-800.

[10] Houben R,Becker JC,Kappel a,et al.Constitutive activation ofthe Ras-Raf signaling pathway inmetastatic melanoma is associated with poor prognosis[J].J Carcinog,2006,3(1):6-18.

[11] 朱琰琰,斯璐,遲志宏,等.中國(guó)黑色素瘤患者BRAF基因突變分析[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2009,14(7)：585-588.