劉雯霞， 陳韓英*， 譚 勇， 王 琪， 李 鵬， 唐代榮

(1.新疆特種植物藥資源省部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832002;2.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832002)

伊犁貝母(Fritillaria pallidi flora Schrenk)為百合科貝母屬植物，其干燥鱗莖是中藥伊貝母的主要來源，有清熱潤肺、化痰止咳功效［1］。伊貝母的主要成分為異甾體生物堿及苷類，尤以西貝素(imperialine)和西貝苷(imperialine-3β-D-glucoside)為其主要成分［2］。藥理研究證明西貝素及其苷對(duì)大鼠離體氣管和支氣管有顯著的松弛作用［3］及抗膽堿能活性［4］，是伊貝母的主要活性成分。

伊貝母傳統(tǒng)用藥多為生品，本實(shí)驗(yàn)基于酒炙能夠增強(qiáng)伊貝母中生物堿的溶出度，采用正交優(yōu)選和高效液相色譜相結(jié)合的方法，對(duì)能夠影響伊貝母中生物堿溶出率的因素如酒的種類，酒的用量和加熱溫度進(jìn)行優(yōu)化，探討不同炮制工藝對(duì)伊貝母中生物堿含量的影響，為伊貝母炮制工藝和臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 HPLC島津LC-20AT高效液相色譜儀(島津);CBM-20A型色譜工作站;SEDEX60 LT型蒸發(fā)光散射檢測器(迪瑪);萬分之一天平(賽多利斯)。

1.2 樣品與試劑 伊貝母藥材購自新疆伊犁，經(jīng)石河子大學(xué)藥學(xué)院中藥系副教授譚勇鑒定為伊犁貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)的干燥鱗莖;西貝素標(biāo)準(zhǔn)品(購自中國藥品生物制品檢定所);乙腈(色譜純，江陰精細(xì)化工研究所)，蒸餾水(三蒸)，二乙胺(分析純，南京化學(xué)工業(yè)公司);白酒(酒精度數(shù)50度，石河子白楊酒廠)，黃酒(酒精度數(shù)13度，紹興糯米老酒)，米酒(酒精度數(shù)10度，化正利源酒廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒炙伊貝母 取凈制的伊貝母100 g，用規(guī)定量不同種類的酒拌勻，悶潤至酒被藥材吸盡，置于烘箱內(nèi)，按照預(yù)定的溫度和時(shí)間分別烘制，中途翻動(dòng)1～2次，取出后放涼備用。

2.2 正交實(shí)驗(yàn) 稱取粉碎并干燥的伊犁貝母粗粉，按表1設(shè)計(jì)的因素水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，見表1。

表1 因素水平表

2.3 西貝素含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX 80A Extend-C18(5 μL，4.6 mm ×250 mm);流動(dòng)相:乙腈-水-二乙胺(80 ∶20 ∶0.05);流速:1.00 mL/min。檢測器參數(shù):漂移管溫度:75℃;氮?dú)饬魉?2.00 L/min;氣壓:200 kPa。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在60℃真空干燥至恒重的西貝素對(duì)照品10.02 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得對(duì)照品貯備液。

2.3.3 供試品溶液的制備 伊貝母各炮制品分別粉碎過40目篩，干燥至恒重，分別精密稱取各粗粉2.0 g，加氨水0.2 mL浸潤1 h，加混合溶劑氯仿-甲醇(4 ∶1)20.0 mL，稱重，混勻，超聲提取25 min，放置過夜，稱重，加混合溶劑補(bǔ)足重量，濾過，棄去初濾液，收集續(xù)濾液10.0 mL，續(xù)濾液于水浴上蒸干，以甲醇溶解，充分洗滌，定容于2 mL量瓶中，以峰面積計(jì)算西貝素含量。其色譜圖見圖1。

圖1 西貝素對(duì)照品(A)，伊犁貝母樣品(B)HPLC色譜圖

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取西貝素對(duì)照品貯備液(1.002 mg/mL)1、0.75、0.5、0.275、0.25 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液20 μL，按上述色譜條件測定。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程 y=1.681 6x-1.830 8，r=0.999 6，線性范圍 0.031 63 ～1.012 μg/mL，結(jié)果表明在此范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系。

2.3.5 樣品的含量測定及結(jié)果分析 按照2.3.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法和2.3.1項(xiàng)下的測定條件，對(duì)各酒炙樣品進(jìn)行含量測定，結(jié)果及分析見圖1及表2、表3。

表2 伊貝母中西貝素含量正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

分析結(jié)果表明，三因素中B因素即酒的用量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大，為伊貝母酒炙的主要影響因素，加熱溫度C為次要因素，各因素對(duì)西貝素含量的影響結(jié)果依次為B＞C＞A。進(jìn)一步的方差分析說明(結(jié)果見表3)，只有因素B對(duì)西貝素的含量有顯著性的影響，綜合分析，在伊貝母酒炙工藝中，最佳工藝條件為A1B3C3，即40 g/100 g凈藥的白酒110～120℃烘干。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一濃度的西貝素對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件，連續(xù)測定6次，記錄峰面積，結(jié)果西貝素峰面積的RSD=1.2%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.6項(xiàng)重復(fù)性試驗(yàn)下同一份供試品溶液，按照上述色譜條件，12 h內(nèi)每2小時(shí)測定一次西貝素的峰面積。結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，其峰面積的RSD=1.8%(n=6)。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取伊犁貝母炮制品1號(hào)粉末1.0 g，平行6份，按2.3.3項(xiàng)供試品制備方法制備供試品溶液，以外標(biāo)法計(jì)算西貝素的含量(%)，計(jì)算測定結(jié)果的RSD為2.8%(n=6)。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的伊犁貝母藥材粉末1.0 g，平行6份，按照高中低分別精密加入西貝素對(duì)照品，按2.3.3項(xiàng)供試品制備方法制備供試品溶液，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果西貝素平均回收率為100.95%。RSD為1.18%。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為確證該工藝的穩(wěn)定性，在上述正交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按篩選的最佳工藝條件，進(jìn)行了重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并與生品進(jìn)行含量對(duì)比。稱取凈制的生品伊貝母100 g，按2.3項(xiàng)下“西貝素含量測定法”各進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，生品伊貝母西貝素平均含量為0.066%(RSD=1.90%)。另取生品伊貝母100 g，按照以上最優(yōu)炮制工藝參數(shù)各進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，炮制伊貝母平均含量為0.092%(RSD=1.80%)，表明優(yōu)選工藝切實(shí)可行。

2.9 水煎液中西貝素含量測定 中藥飲片多為水煎使用，該實(shí)驗(yàn)對(duì)生品及炮制品中西貝素含量進(jìn)行比較。取2.8項(xiàng)下樣品，分別精密稱取各粗粉2.0 g，加水20.0 mL，稱重，混勻，煎煮 60 min，放置過夜，稱重，加水補(bǔ)足重量，濾過，棄去初濾液，收集續(xù)濾液10.0 mL，續(xù)濾液于水浴上蒸干，以甲醇溶解，充分洗滌，定容于2 mL量瓶中，以峰面積計(jì)算西貝素含量。結(jié)果見表5。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所用的流動(dòng)相為乙腈-水-二乙胺，經(jīng)查閱相關(guān)資料，有3種比例可用于該實(shí)驗(yàn)，分別為55∶45 ∶0.05、70 ∶30 ∶0.05、80 ∶20 ∶0.05，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，80∶20∶0.05為最佳流動(dòng)相比例。

表5 生品與炮制品伊貝母水煎液西貝素含量比較

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知，酒的用量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響，得到最佳工藝條件為A1B3C3，即40 g/100 g凈藥的白酒110～120℃烘干。因此在對(duì)伊貝母進(jìn)行酒炙時(shí)必須注意酒的用量，該實(shí)驗(yàn)認(rèn)為110～120℃為最佳溫度條件，可能是溫度升高后有利于伊貝母中生物堿的溶出。驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)生品伊貝母與最佳工藝炮制品西貝素含量比較，生品伊貝母明顯低于炮制品含量。并分別對(duì)其水煎液進(jìn)行含量測定，同樣生品水煎液中西貝素含量明顯低于炮制品。可見經(jīng)酒制能夠明顯提高伊貝母中西貝素的溶出率。

實(shí)驗(yàn)優(yōu)選最佳工藝40 g/100 g凈藥的白酒110～120℃烘干與傳統(tǒng)工藝低度黃酒工藝不一致，筆者認(rèn)為伊貝母中西貝素屬西藜蘆堿類，為極性較小的脂溶性生物堿，降低極性能夠增加西貝素溶出，白酒度數(shù)較黃酒高，就達(dá)到了西貝素溶出率提高的目的，同時(shí)酒的用量也較傳統(tǒng)10～30 g用量高，同樣反映出了極性對(duì)西貝素溶出率的影響。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:95-96.

［2］伊江蘭，麥迪尼亞提.伊貝母總生物堿的研究概述［J］.新疆中醫(yī)藥，2002，20(4):77-79.

［3］Chan SW，Kwan Yw，Lin G，et al.The effects of Fritillaria alkaloids on isolated trachea and bronchi［J］.Pharm Sci，1998，1:369.

［4］Atta-ttr-Rahman，Choudhary MI，F(xiàn)arooq A，et al.Structure activity relationships of imperialine derivatives and their antichotinergic activity［J］.Planta Med，1998，64(2):172-174.