霍 利 呂運(yùn)開 丁天惠

(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，保定 071002) (河北保定天慧分離科學(xué)研究所，保定 071002)

三聚氰胺(melamine)簡(jiǎn)稱三胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物[1]，主要用于生產(chǎn)三聚氰胺-甲醛樹脂，廣泛用于木材加工、塑料、涂料、皮革、醫(yī)藥等行業(yè)。由于經(jīng)典的凱氏定氮法無法測(cè)定氮的來源，不法商人便將其加入飼料，甚至奶粉中，冒充蛋白質(zhì)，提高產(chǎn)品的表觀蛋白質(zhì)含量，從中謀取暴利。自2007年在美國(guó)爆發(fā)寵物食品受三聚氰胺污染事件及2008年我國(guó)爆發(fā)了嬰幼兒因食用了含三聚氰胺的奶粉而致腎結(jié)石甚至死亡的惡性事件后，食品中添加三聚氰胺才引起廣泛的重視。

目前三聚氰胺的檢測(cè)方法主要為液相色譜法(LC)[2-8]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[9,10]和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[11-17]及免疫學(xué)法。LC是目前最常用的測(cè)定方法，但由于三聚氰胺屬于強(qiáng)極性化合物，其在普通的C18色譜柱上幾乎無保留，因此需在流動(dòng)相中添加庚烷磺酸鈉或者辛烷磺酸鈉等離子對(duì)試劑以得到較好的保留。GC-MS和LC-MS均可作為三聚氰胺的確證方法，但設(shè)備價(jià)格昂貴，運(yùn)行成本高，不易普及。毛細(xì)管電泳是近十年來蓬勃發(fā)展的一種檢測(cè)方法，因其具有分離效率高且經(jīng)濟(jì)環(huán)保的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。目前毛細(xì)管電泳檢測(cè)三聚氰胺方法的報(bào)道較少，主要原因是國(guó)家規(guī)定的三聚氰胺限量嚴(yán)格，如嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg，液態(tài)奶(包括原料乳)、奶粉及其它配方乳粉中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg，而毛細(xì)管電泳對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)靈敏度低，一般情況下無法直接檢測(cè)，需要復(fù)雜的柱前富集過程。饒欽雄等[18]采用三氯乙酸沉淀牛奶中蛋白質(zhì)，高速離心分離，經(jīng)MCX柱凈化富集，毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)牛奶中三聚氰胺，方法的檢出限為0.5 mg/kg；Tsai等[19]同樣采用了高速離心和MCX柱凈化富集，在線富集毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)奶中三聚氰胺，方法的檢出限為0.5 mg/kg。

筆者著重研究了樣品前處理方法和高效毛細(xì)管電泳濁度法，從而避免了復(fù)雜的柱前富集過程和繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作步驟，旨在建立簡(jiǎn)便、低成本、準(zhǔn)確靈敏的牛奶和奶粉中三聚氰胺的高效毛細(xì)管電泳直接測(cè)定方法，使之成為企業(yè)和檢測(cè)部門的普適檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效毛細(xì)管電泳儀：TH-3000型，配紫外檢測(cè)器，河北省保定市天惠分離科學(xué)研究所；

離心機(jī)：80-2B型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

酸度計(jì)：PHS-3C型，上海偉業(yè)儀器廠；

超聲波清洗器：KH3200B型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；

三氯乙酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉：分析純；

十二烷基硫酸鈉(SDS)：純度大于99%；

三氯乙酸溶液：1%，將1 g三氯乙酸固體溶于水中定容至100 mL；

氫氧化鈉溶液：將1.9 g氫氧化鈉溶于水中并定容至50 mL；

磷酸鹽緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取40 mg磷酸二氫鈉溶于25 mL水中，加入300 μL濃磷酸，750 μL三氯乙酸水溶液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 2.05～2.07，加入25 mg SDS，混勻后超聲5 min，密閉保存；

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于99%；

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液：用三氯乙酸溶液溶解三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)需要稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；

實(shí)驗(yàn)用水為自制二次蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

(1)樣品的前處理方法

稱取牛奶或奶粉樣品5.0 g(精確至0.01 g)，加入1%三氯乙酸溶液混勻并定容至25 mL，渦旋1 min，超聲5 min，加熱至沸騰后自然冷卻，以4 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾，待測(cè)。

(2)電泳條件

毛細(xì)管柱：50 cm×75 μm，河北永年銳灃色譜器件有限公司；分離電壓：13 kV；溫度：25℃；進(jìn)樣量：12.3 kPa×3 s；檢測(cè)波長(zhǎng)：236 nm。

(3)實(shí)驗(yàn)步驟

毛細(xì)管柱使用前依次用0.1 moL/L NaOH溶液、0.1 moL/L鹽酸溶液、超純水、緩沖溶液各沖洗3 min；兩次進(jìn)樣間用緩沖溶液沖洗3 min。沖洗完畢后將樣品裝柱，在12.3 kPa的壓力下，進(jìn)樣3 s后，在13 kV電壓條件下開始檢測(cè)并收集數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 濁度法電泳條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在一定的pH范圍內(nèi)，一定比例的三聚氰胺、三氯乙酸和SDS可生成沉淀，反應(yīng)液的濁度隨之增加，通過在緩沖溶液中添加三氯乙酸和SDS可明顯提高檢測(cè)靈敏度，且與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，三聚氰胺的峰面積Y(μV·s)與質(zhì)量濃度c(mg/L)之間呈良好線性關(guān)系。該法與普通毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法相比，儀器的檢測(cè)靈敏度可提高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，且特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好。

(1)緩沖溶液的選擇

考察了磷酸鹽-磷酸、甲酸-甲酸銨和磷酸鹽-鹽酸緩沖體系。實(shí)驗(yàn)顯示，三聚氰胺在磷酸鹽-磷酸緩沖溶液中的響應(yīng)高，體系穩(wěn)定，故實(shí)驗(yàn)選定磷酸鹽-磷酸緩沖溶液為緩沖溶液。

考察10 、20 、30 mmol/L NaH2PO4的分離效果。結(jié)果表明，其分離效果相當(dāng)?？紤]到低離子強(qiáng)度時(shí)，電流小，遷移時(shí)間短；高離子強(qiáng)度時(shí)，電流大，噪聲大，遷移時(shí)間長(zhǎng)，故確定緩沖溶液中NaH2PO4濃度為10 mmol/L。

在緩沖溶液中添加SDS后，方法靈敏度有了明顯提高，隨著SDS加入量的提高，靈敏度也越來越高，但遷移時(shí)間也延長(zhǎng)。SDS濃度對(duì)0.2 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)靈敏度的影響情況見表1。根據(jù)表1結(jié)果，實(shí)驗(yàn)選定緩沖溶液中加入SDS的濃度為1 mg/mL。

表1 SDS添加量對(duì)緩沖溶液的影響

緩沖溶液pH值對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響見表2。當(dāng)對(duì)添加濃度為1 mg/kg的樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，緩沖溶液pH值對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響很明顯。只有精確控制緩沖溶液的pH 值為2.05～2.07，再加入適量的SDS，靈敏度才能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

表2 pH值對(duì)緩沖溶液的影響

(2)其它電泳條件的選擇

實(shí)驗(yàn)對(duì)不同的電壓和進(jìn)樣量進(jìn)行了比較。較高電壓可以提高三聚氰胺的響應(yīng)值，但隨著電壓增加，電流增大，基線噪聲加大，毛細(xì)管中緩沖溶液發(fā)熱并產(chǎn)生氣泡，發(fā)生斷流現(xiàn)象，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過加大進(jìn)樣量可以提高儀器的響應(yīng)值，但是進(jìn)樣量過大會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)管因超載而出現(xiàn)分離度降低、峰展寬等現(xiàn)象。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最后選擇分離電壓為13 kV、進(jìn)樣量為12.3 kPa×3 s。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇和優(yōu)化

由于三聚氰胺是極性化合物，可溶于弱酸，而牛奶樣品中含有豐富的蛋白質(zhì)，所以選用1%三氯乙酸水溶液作提取溶劑。經(jīng)大量的樣品試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加熱試樣至沸騰，再自然冷卻，既不影響對(duì)三聚氰胺的提取，又可以把蛋白去除干凈。經(jīng)加熱的試樣不需要高轉(zhuǎn)速離心就可以較完全沉降蛋白，上層清液可直接過膜上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)顯示，樣品的pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大影響，經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，在每25 mL工作溶液中加入120 μL氫氧化鈉溶液，可明顯改善低濃度三聚氰胺的峰型。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用1%的三氯乙酸水溶液稀釋儲(chǔ)備液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.2、1、2、4、8、10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

在1.2(2)電泳條件下進(jìn)樣測(cè)定，三聚氰胺的峰面積Y(μV·s)與質(zhì)量濃度c(mg/L)之間呈良好線性關(guān)系。線性回歸方程為Y=1 610.3c+401.7，相關(guān)系數(shù)r2=0.999。

2.4 精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn)

在對(duì)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，溶液濃度為0.2 mg/L時(shí)，信噪比S/N=6，故方法的定量限為0.2 mg/L。取空白牛奶和奶粉樣品，添加三聚氰胺工作溶液，添加水平為1、5、10 mg/kg，按1.2實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。空白樣品和添加定量限水平(1.0 mg/kg)的樣品譜圖見圖1～圖4。每個(gè)添加水平測(cè)定5個(gè)平行樣，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算結(jié)果列于表3。

圖1 空白奶樣的毛細(xì)管電泳譜圖

圖2 添加1.0 mg/kg三聚氰胺奶樣的毛細(xì)管電泳譜圖

圖3 空白奶粉樣品的毛細(xì)管電泳譜圖

圖4 添加1.0 mg/kg三聚氰胺奶粉樣品的毛細(xì)管電泳譜圖

樣品添加量/mg·kg-1測(cè)得量/mg·kg-1回收率/%RSD/%牛奶15100.8324.8009.75083.296.097.52.72.81.8奶粉15100.8394.8809.37083.996.693.73.43.02.5

3 結(jié)論

毛細(xì)管電泳法在分析離子化合物方面具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，而且分離效率高，時(shí)間短，重現(xiàn)性好，分離模式多種多樣；在前處理時(shí)，加入三氯乙酸后加熱樣品，改善了去除牛奶和奶粉中蛋白質(zhì)的效果，提高了對(duì)三聚氰胺的提取效率，尤其在檢測(cè)時(shí)利用濁度法通過對(duì)緩沖溶液pH值的精確控制的改進(jìn)和SDS的添加，提高了儀器檢測(cè)的靈敏度。在不進(jìn)行柱前富集的情況下，靈敏度與高效液相色譜法相近，而且樣品前處理更簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，定量限可達(dá)1 mg/kg。該法可用于大量牛奶和奶粉樣品中三聚氰胺的快速檢測(cè)。

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