劉 妍，靳存敬，楊素娟，賈 兵，王 凡，劉昭飛，2，*

1.北京大學 醫(yī)學同位素研究中心，北京 100191 2.北京大學 基礎醫(yī)學院 放射醫(yī)學教研室，北京 100191

EGFR(表皮生長因子受體，epidermal growth factor receptor)是具有配體依賴性和酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白家族，它在多種人類腫瘤中均呈現(xiàn)高表達，如結(jié)直腸癌、乳腺癌和非小細胞肺癌等。EGFR對于調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、生存、修復、新生血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等具有重要的作用[1-2]，因此它成為目前腫瘤分子靶向治療的重要靶點。近些年來，人們一直致力于尋找能抑制EGFR表達或阻斷EGFR信號傳導的抗癌療法，而開發(fā)可拮抗EGFR胞外配體結(jié)合區(qū)的單克隆抗體成為這其中的一個熱點。這種靶向療法降低了傳統(tǒng)的細胞毒療法對正常組織的毒性，并且靶向治療與傳統(tǒng)療法聯(lián)合使用可能產(chǎn)生協(xié)同作用[3]。另外，目前用不同放射性核素標記的靶向EGFR抗體已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，并用于腫瘤的SPECT和PET顯像以及腫瘤治療的研究[4-6]。

Panitumumab(ABX-EGF)是第一個EGFR靶向的完全人源化單克隆抗體(IgG2亞型)，由Abgenix和Amgen公司采用XenoMouseTM技術(shù)從一組該類抗體中篩選獲得。Panitumumab與EGFR具有高親和性，與EGFR結(jié)合從而阻止其配體EGF和TGF-α(transforming growth factor-α，轉(zhuǎn)化生長因子α)等與EGFR的結(jié)合，進而阻止下游信號的激活。2006年9月，Panitumumab被FDA批準，用于治療常規(guī)化療后轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者[7-8]。Niu等[9]首先用64Cu標記Panitumumab用于高表達EGFR的腫瘤模型的PET顯像，而其它核素標記的Panitumumab國內(nèi)外尚無文獻報道。在本研究中，采用125I和111In分別標記Panitumumab，在體外測定標記物的免疫活性，并對其在正常鼠體內(nèi)的生物分布進行比較，其目的是評價不同的放射性核素標記對抗體體內(nèi)外性質(zhì)的影響。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

111InCl3溶液和Na125I溶液(無載體)，美國Perkin Elmer公司；完全人源化抗表皮生長因子受體(EGFR)單克隆抗體Panitumumab(Vectibix，帕尼單抗)，美國斯坦福大學陳小元教授惠贈；快速薄層層析-硅膠紙(ITLC-SG)，美國Gelman公司；PD-10脫鹽柱(Sephadex G-25)，美國GE公司；Iodogen (1,3,4,6-四氯3,6 -二苯-甘脲)，美國Sigma公司；雙功能偶聯(lián)劑DOTA，購自美國Macrocyclics公司；1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)-propyl]carbodiimide(EDC)及N-hydro-xysulfonosuccinimide(SNHS)，購自美國Sigma公司；DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基和胰蛋白酶，美國GIBCO/BRL公司；胎牛血清，美國Hyclone公司；Tween-20，美國Sigma公司；其它常規(guī)化學試劑均為分析純，北京試劑公司產(chǎn)品。

所用緩沖液、槍頭、反應管等均經(jīng)去離子處理，所有實驗用水為去離子水(18.2 MΩ)。

1.2 儀器

CRC-15R放射性活度計，美國Capintec公司；1470-002全自動γ計數(shù)儀，美國Perkin Elmer公司；AR-2000放射性薄層掃描儀，美國Bioscan公司。

1.3 實驗動物

BALB/c小白鼠，4～5周齡，雌性，約20 g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。

2 實驗方法

2.1 DOTA偶聯(lián)Panitumumab

采用我們前期報道的方法將雙功能偶聯(lián)劑DOTA活化[10]。簡言之，DOTA(100 μL，溶于0.1 mol/L NaOH)與EDC(100 μL，溶于H2O)和SNHS(100 μL，溶于H2O)按照n(DOTA)∶n(EDC)∶n(SNHS)=10∶5∶4的摩爾比混合，置4 ℃反應30 min。將活化好的DOTA(DOTA-OSSu)與抗EGFR單克隆抗體Panitumumab以1∶200的摩爾比混合，在0.1 mol/L NaHCO3溶液(pH=9.0)中4 ℃振蕩反應過夜后，反應混合液用PD-10脫鹽柱純化。根據(jù)DOTA-Panitumumab及已知濃度的Panitumumab在280 nm波長處的吸光度值計算DOTA-Panitumumab的濃度。

2.2 Panitumumab及DOTA-Panitumumab的125I標記

將15 μL Panitumumab(300 μg)和30 μL DOTA-Panitumumab(300 μg)分別加至2個涂有50 μg Iodogen的小瓶中，再分別加入135 μL和120 μL的磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH=7.4)，然后分別向瓶中加入12 μL Na125I溶液(約25.6 MBq)，混合均勻室溫反應5 min后，吸出反應液以終止反應。反應混合物分別經(jīng)PD-10脫鹽柱純化(以PBS為流動相)后備用。

2.3 111In-DOTA-Panitumumab的制備

1.5 mL EP(Eppendorf)管中分別加入50 μL的0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH=5.5)、200 μg DOTA-Panitumumab(20 μL)以及20 μL111InCl3(約111 MBq)。37 ℃振蕩反應1 h后，用PD-10柱純化產(chǎn)物111In-DOTA-Panitumumab，以PBS為流動相。

2.4 質(zhì)控方法

質(zhì)控采用快速薄層層析法(ITLC)。取1 μL標記產(chǎn)物點樣于ITLC-SG板(10 mm×100 mm)，125I標記物在85%甲醇的展開體系中上行展開，111In標記物在10 mmol/L EDTA的展開體系中展開，自然晾干后用放射性薄層掃描儀測量并計算標記率或放射化學純度。

2.5 111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab的體外穩(wěn)定性

取100 μL純化后的111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab分別置于生理鹽水(NS)和胎牛血清(FBS)溶液中，37 ℃振蕩孵育。用ITLC監(jiān)測不同時間點的放射化學純度，以評價標記物的體外穩(wěn)定性。

2.6 細胞培養(yǎng)

UM-SCC-22B人頭頸癌細胞購自美國ATCC,培養(yǎng)于φ=10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中。細胞置于飽和濕度、37 ℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。UM-SCC-22B細胞高表達表皮生長因子受體(EGFR)[11]。

2.7 111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab的放射免疫活性測定

取6個EP管分為總結(jié)合組和非特異性結(jié)合組，每組3個平行樣。每管均加入500 μL細胞懸液(約106個細胞)和100 μL111In-DOTA-Panitumumab(約167 Bq)稀釋液。然后在總結(jié)合組中每管加入100 μL 1% BSA(溶于PBS)；非特異性結(jié)合組中每管加入100 μL過量未標記Panitumumab(約100 μg，溶于1% BSA)溶液。反應管混合均勻后，置于4 ℃層析柜中輕輕振蕩反應過夜。結(jié)束后取出試管，離心，并用PBS反復洗滌4～6次。離心后經(jīng)γ計數(shù)器測定每管細胞結(jié)合的放射性計數(shù)率(min-1)，計算放射免疫活性(細胞結(jié)合量/加入總量)。

125I-Panitumumab的放射免疫活性測定步驟同上。

2.8 正常鼠體內(nèi)生物分布

將60只BALB/c小白鼠隨機分成3組，每組20只。每組分別經(jīng)尾靜脈注射185 kBq(100 μL溶于生理鹽水)125I-Panitumumab、DOTA-Panitumumab-125I及111In-DOTA-Panitumumab，并于注射后4 h、1 d、3 d、5 d和7 d按組(每組4只)將實驗小鼠處死，取血及主要臟器，稱重并用γ計數(shù)儀測量放射性計數(shù)，經(jīng)衰變校正后計算每克組織的百分注射劑量率(Up，%ID/g)。

2.9 數(shù)據(jù)分析

使用Prism 4.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，P≤0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果和討論

3.1 標記物的制備與質(zhì)控

標記物的標記率和放化純結(jié)果列于表1。Panitumumab及DOTA-Panitumumab均具有較高的111In和125I標記率，然而111In標記物的標記率(88%)明顯低于125I標記物的標記率(94%)，這可能是由于111In需要通過雙功能螯合劑與抗體偶聯(lián)，所以它比125I更難標記到抗體上。經(jīng)PD-10脫鹽柱純化后，111In和125I標記的Panitumumab均具有高的放射化學純度(>98%)。

3.2 111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab的體外穩(wěn)定性結(jié)果

通過對111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab在生理鹽水(NS)和胎牛血清(FBS)中的放射化學純度監(jiān)測(圖1)顯示，2種標記物在體外均有很好的穩(wěn)定性，72 h時，在2種介質(zhì)中的放化純均大于90%。

圖1 125I-Panitumumab(a)和111In-DOTA-Panitumumab(b)在生理鹽水(NS)和胎牛血清(FBS)中的穩(wěn)定性Fig.1 In vitro stability of 125I-Panitumumab(a) and 111In-DOTA-Panitumumab(b)in saline (NS) and fatal bovine serum (FBS)×——NS，□——FBS

3.3 111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab的放射免疫活性分數(shù)測定結(jié)果

111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab的放射免疫活性分數(shù)分別為(58.32±4.84)%和(81.66±3.15)%(圖2)，說明2種標記物均保持了良好的免疫活性。111In-DOTA-Panitumumab的放射免疫活性低于125I-Panitumumab，這可能是由于雙功能螯合劑與抗體偶聯(lián)過程對抗體活性有一定的影響。

3.4 125I-Panitumumab、DOTA-Panitumumab-125I和111In-DOTA-Panitumumab在正常鼠內(nèi)的生物分布

表2—4分別列出了125I-Panitumumab、DOTA-Panitumumab-125I和111In-DOTA-Panitumumab在BALB/c小白鼠體內(nèi)的分布數(shù)據(jù)，圖3比較了這3種標記物在主要臟器及血液中的清除情況。

根據(jù)生物分布數(shù)據(jù)，在注射后4 h，3種標記物111In-DOTA-Panitumumab、125I-Panitumumab和DOTA-Panitumumab-125I在血液中的放射性攝取分別為(46.65±3.96)、(39.08±1.16)、(36.77±3.03)%ID/g，隨著時間的延長，3種標記物在血液中迅速清除，到注射后168 h，它們在血液中的放射性攝取分別降至(3.63±2.64)、(14.16±1.00)、(1.69±0.13)%ID/g。3種標記物在腎臟中的放射性攝取較低，在肝臟和脾臟中的放射性攝取較高，說明標記物主要是通過肝臟代謝的。3種標記物在肝臟和脾臟中的放射性攝取差異最大(圖2)。111In-DOTA-Panitumumab在實驗過程中所有時間點的肝臟攝取都顯著高于DOTA-Panitumumab-125I和125I-Panitumumab(P<0.000 1)。這可能是由于3種標記物的代謝產(chǎn)物在體內(nèi)分布性質(zhì)的不同造成的。標記物經(jīng)肝臟代謝時，會進入肝細胞內(nèi)的溶酶體，經(jīng)過蛋白酶裂解后產(chǎn)生代謝產(chǎn)物[12]，這些代謝產(chǎn)物要通過簡單擴散或者氨基酸轉(zhuǎn)運子離開溶酶體腔。根據(jù)Duncan等[13]推測，111In-DOTA-Panitumumab的代謝終產(chǎn)物大部分為111In-DOTA-lysine(賴氨酸)，由于溶酶體中不存在轉(zhuǎn)運它的轉(zhuǎn)運子，所以它難以離開肝細胞，從而造成了放射性在肝細胞中的滯留。而125I標記物的代謝產(chǎn)物在細胞質(zhì)中易發(fā)生脫碘作用，游離碘很容易從細胞內(nèi)溢出[14]。在注射后4 h，125I-Panitumumab在肝臟中的攝取為(6.24±0.77)%ID/g，也顯著低于DOTA-Panitumumab-125I((10.99±1.34)%ID/g，t=6.136，P=0.000 9)，說明了DOTA的連接本身也會增加肝臟的攝取。這可能是由于DOTA-Panitumumab的代謝產(chǎn)物具有陰離子性質(zhì)，在pH=5.0的溶酶體中難以進行簡單擴散，所以連有DOTA的標記物在肝臟中更容易累積。另外，從生物分布數(shù)據(jù)中還可以看出，3種標記物在肺中的攝取也較高，這可能是由于EGFR在正常的肺組織中也有少量的表達[15]。

圖2 125I-Panitumumab(a)和111In-DOTA-Panitumumab(b)的放射免疫活性分數(shù)Fig.2 Radioimmunoreactive fractions of 125I-Panitumumab (a) and 111In-DOTA-Panitumumab (b)

組織(Tissues)Up/(%ID·g-1)4h1d3d5d7d血(Blood)39 08±1 1628 26±1 7022 14±2 2415 41±1 5314 16±1 00肝(Liver)6 25±0 774 04±0 533 12±0 671 94±0 262 29±0 58脾(Spleen)4 64±0 383 15±0 382 40±0 411 92±0 211 69±0 28腎(Kidney)8 46±0 305 69±0 173 31±0 742 96±0 313 04±0 15胃(Stomach)3 84±0 483 34±0 393 03±0 692 32±0 171 88±0 09腸(Intestines)7 11±1 075 40±0 575 47±0 743 77±0 613 22±0 33心(Heart)7 50±0 125 04±0 593 90±0 802 62±0 302 36±0 27肺(Lung)13 14±2 828 78±1 567 01±1 005 23±0 585 13±0 55肌肉(Muscle)1 70±0 282 52±0 362 09±0 401 40±0 151 17±0 14骨(Bone)3 43±0 892 28±0 591 65±0 271 16±0 200 92±0 11

注(Note)：n=4

表3 DOTA-Panitumumab-125I的正常鼠生物分布Table 3 Biodistribution of DOTA-Panitumumab-125I in normal mice

注(Note)：n=4

表4 111In-DOTA-Panitumumab的正常鼠生物分布Table 4 Biodistribution of 111In-DOTA-Panitumumab in normal mice

注(Note)：n=4

圖3 3種標記物在血液(a)、肝臟(b)、腎臟(c)和脾臟(d)中的清除情況比較Fig.3 Comparison of blood (a), liver (b), kidney (c), and spleen (d) clearance of three tracers□——125I-Panitumumab，▲——DOTA-Panitumumab-125I，×——111In-DOTA-Panitumumab

以上實驗結(jié)果顯示，125I標記簡單，對標記物活性影響小，但125I標記物在體內(nèi)容易脫碘，所以不能準確地反映出標記物在體內(nèi)分布的情況。雖然111In標記對抗體活性影響比125I大，但仍然保持較好的免疫活性，并且111In標記物在體內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，更能體現(xiàn)出抗體在體內(nèi)的分布情況。然而，111In標記物的最大缺點是在肝臟中攝取較高，滯留時間較長。因此在應用111In作為顯像核素時，如何降低標記物在肝臟中的攝取還有待研究。

4 結(jié) 論

本研究中，Panitumumab的125I和111In標記均具有較高的標記率，經(jīng)PD-10純化后放化純均高于98%。125I和111In標記的Panitumumab均具有較高的體外免疫活性，且125I-Panitumumab具有比111In-DOTA-Panitumumab更高的放射免疫活性分數(shù)。生物分布實驗數(shù)據(jù)顯示，在實驗中所有的時間點，111In-DOTA-Panitumumab在肝臟和脾臟中的攝取均顯著高于125I標記物，說明不同核素標記對生物分子的體內(nèi)外性質(zhì)具有一定的影響。雖然相對于易在體內(nèi)脫碘的125I標記抗體，111In標記物在體內(nèi)較為穩(wěn)定，但是如何降低111In標記物在肝臟中的攝取還有待研究。

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