何佳恒，蔣樹斌，楊玉青，王關(guān)全

中國工程物理研究院 核物理與化學研究所，四川 綿陽 621900

骨無機相主要成分為磷酸配合物-羥基磷灰石，前期研究表明，磷(膦)類配體(配合物)對其有較強的趨附性[1-5]。20世紀80年代，人們合成了EDTA的膦酸衍生物乙二胺四甲基膦酸(EDTMP)，并制備了153Sm-EDTMP[6]。90年代羅順忠等[6-7]在對153Sm-EDTMP的研究中發(fā)現(xiàn)該配合物有很高的親骨性并能高度聚集在骨損傷部位。鄧候富等[7]用153Sm-EDTMP成功治療了多例轉(zhuǎn)移性骨腫瘤患者。幾種用于骨腫瘤核素的物理性質(zhì)列入表1。鑭系元素153Sm有比較優(yōu)良的核性質(zhì)：半衰期為46.3 h，β射線能量適合治療(0.805 MeV(21%)、0.702 MeV(46%)、0.632 MeV(33%))，可殺死癌細胞，主要的γ射線能量適中(0.103 MeV(28.2%))，適宜于γ照相機和SPECT顯像。從20世紀80年代開始，186Re和188Re就引起了人們的極大興趣，目前研究較多的是186Re-HEDP[8-9]?，F(xiàn)在，以膦酸配體為基礎，人們正研究一系列186，188Re-膦酸配體配合物作潛在的骨腫瘤治療藥物，但研究距臨床尚有一定的距離。117Snm有最低能量的電子但仍能穿透大約30個細胞直徑，這對于產(chǎn)生療效而又不傷及紅骨髓已經(jīng)足夠。為了突破骨髓抑制效應，同時保持或提高骨病灶濃集比例，人們將關(guān)注熱點在近十年內(nèi)轉(zhuǎn)向了117Snm及其標記化合物[10-14]，一系列含此核素的化合物被研究。

鑒于配體EDTMP良好的骨趨附性，本工作擬選用上述2種性質(zhì)優(yōu)良的親骨核素188Re、117Snm[8,10,15]對EDTMP進行標記，比較3種配合物117Snm(188Re、153Sm)-EDTMP在小鼠體內(nèi)的分布，評價188Re(117Snm)-EDTMP作為骨腫瘤治療藥物的可能性。其中117Snm-EDTMP屬國內(nèi)外首次研究，未見文獻報道。

表1 幾種用于骨腫瘤核素的物理性質(zhì)Table 1 Physical characteristics of radio nuclides used for palliation of bone tumor

1 實驗部分

1.1 主要試劑及儀器

117Snm(188Re、153Sm)，中國工程物理研究院核物理與化學研究所提供；其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純或化學純；實驗所需用水均為二次蒸餾水。

FJ-2021型γ放射免疫計數(shù)器，國營二六二廠；紅外光譜儀、元素分析儀、熔點測定儀由中國科學院成都有機研究所提供；CAPINTEC CRC-15R放射性活度測量儀，美國丹佛儀器公司；Helix Apex雙探頭SPECT儀，以色列Elscint公司。

昆明種小白鼠，一級，體重(18±2) g，雌雄各半，均由四川大學華西醫(yī)學中心動物實驗中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1EDTMP的制備 在三頸瓶中加入乙二胺、亞磷酸、濃鹽酸，在回流攪拌下，水浴加熱至95 ℃左右，經(jīng)恒壓進樣器緩慢滴加36%甲醛水溶液，體系經(jīng)如下Mannich反應[16]制得EDTMP：

產(chǎn)品經(jīng)紅外、元素分析表征。

1.2.2153Sm-EDTMP的制備 采用文獻[17]報道的直接標記法。在反應器中，加入一定量的EDTMP和153SmCl3,調(diào)節(jié)體系pH,使反應在一定的溫度環(huán)境(室溫或沸水浴)下進行。

1.2.4117Snm-EDTMP的制備 采用文獻[3-4]報道的方法制備。將EDTMP溶于水，調(diào)節(jié)pH值至7左右，然后加入117Snm(Ⅱ)，加入配體和117Snm(Ⅱ)的摩爾比為10∶1。充分反應后，加入H2O2(n(H2O2)∶n(117Snm(Ⅱ))=10∶1)，待其完全氧化后，加熱以趕走多余的H2O2。

1.2.5117Snm(188Re、153Sm)-EDTMP的穩(wěn)定性及親脂性

(1) 標記化合物的穩(wěn)定性

將制備好的配合物分別置于室溫(約25 ℃)、37 ℃，用紙層析法檢測放化純度隨時間的變化。

(2) 標記化合物的親脂性

采用文獻[20]中水/正辛醇法測定各配合物的脂水分配系數(shù)。將標記配合物用生理鹽水緩沖液(pH=7)稀釋至3 mL，再加入3 mL正辛醇，振蕩離心后，取2 mL下層的水相至測量管中放置測量計數(shù)。在有機相中再加入3 mL生理鹽水振蕩離心，棄去水相，如此反復不少于5次，最后取2 mL有機相測量計數(shù)。分配系數(shù)Kow=co/ca=No/Na。其中，co為配合物在正辛醇相中的濃度；ca為配合物在水相的濃度；No為正辛醇相中放射性總計數(shù)；Na為水相中放射性總計數(shù)。

1.2.6動物實驗 對于每種配合物，分別取75只小白鼠，隨機分成3組，每組再隨機分成5批，每批5只。每組通過尾靜脈注射0.1 mL相同劑量的標記物(18.5 kBq)。于不同時間將小鼠斷頭處死，取感興趣臟器稱量，測其放射性，計算每克組織攝入放射性占總注入劑量的百分比(%ID/g)。

2 結(jié)果和討論

2.1 EDTMP的表征

EDTMP的熔點分析結(jié)果為201.3 ℃。

元素分析結(jié)果如下：N，5.92%；C，15.31%；H，4.71%；P，25.81%。計算值：N，6.17%；C，15.86%；H，4.83%；P，27.31%。圖1是采用Gaussian優(yōu)化的EDTMP結(jié)構(gòu)。

EDTMP的紅外光譜示于圖2。

圖1 經(jīng)過Gaussian優(yōu)化的EDTMP結(jié)構(gòu)Fig.1 Optimized structure by Gaussian program

圖2 EDTMP的紅外光譜圖Fig.2 IR spectrum of EDTMP

2.2 配合物的制備

在生理鹽水中，水解Sn在原點，四價Sn配合物在前沿(Rf為0.8～0.95)；在丙酮中，水解Sn和四價配合物都在原點。

在153Sm-EDTMP的合成中，弱堿性介質(zhì)有利于配合物的生成，但堿性過高會造成Sm3+的水解而使配合物不穩(wěn)定，要達到98%的標記率，pH≥5即可，考慮動物實驗的需要，選擇pH=8～9。標記選擇在沸水浴中進行。在選擇配體量時發(fā)現(xiàn)，在pH≈8時，如果配體量較少，標記率會隨配體量的增加而上升，當標記率已較高(大于96%)時，配體的增加幾乎不會提高配合產(chǎn)率。

EDTMP與117Snm(Ⅳ)的標記條件溫和，在常溫下反應15 min即可獲得標記率大于95%的配合物。配體量和酸度對溶液的外觀影響很大，為了避免Sn的水解，需要配體與117Snm的摩爾比大于10，待充分反應后緩慢調(diào)節(jié)溶液的酸度至7左右。否則配體量不足容易導致多余的Sn水解。調(diào)節(jié)溶液的酸度要盡量避免將溶液的酸度調(diào)到堿性，需要緩慢從酸性調(diào)節(jié)到7左右備用。因為在堿性條件下，Sn的配合物也很容易水解，并且隨著堿性增大，配合物的水解程度加劇。水解形成的微小膠狀物(117SnmO2·xH2O·yEDTMP(x≥0，y≥0))很容易滯留在動物的肝部，對非靶組織造成不必要的損傷，使靶向組織的療效受到影響。

2.3 配合物的穩(wěn)定性和親脂性

153Sm-EDTMP的穩(wěn)定性結(jié)果表明，在pH=4時，放化純在7 d時略有下降，但仍不低于96%；而在pH=7和9時，即使放置了7 d放化純也在98%左右，說明153Sm-EDTMP在較寬的pH范圍內(nèi)有很高的體外穩(wěn)定性；可適當增加配體用量來提高標記物的穩(wěn)定性；配合物在37 ℃的恒溫水浴中放置7 d后測得其放化純?nèi)源笥?5%。

將117Snm-EDTMP在室溫下放置5 d后放化純?nèi)愿哂?5%；將標記率大于95%的標記物放置在37 ℃的恒溫水浴槽中，8 h后測其放化純?nèi)源笥?5%。

188Re-EDTMP在室溫下放置5 d后放化純由95%降到93.2%；放置在37 ℃的恒溫水浴槽中，8 h后測得其放化純保持在90%左右。

以上結(jié)果顯示，3種配合物較好的體外穩(wěn)定性為進一步的生物性質(zhì)研究提供了保證。

配合物153Sm-EDTMP、117Snm-EDTMP和188Re-EDTMP的Kow分別為2.6×10-3、1.3×10-3和1.8×10-3，表明三者都是親水性的，利于它們在骨骼上的吸附。

2.4 117Snm(153Sm、188Re)-EDTMP

153Sm-EDTMP、117Snm-EDTMP、188Re-EDTMP的小鼠體內(nèi)分布分別列于表2—表4。經(jīng)過比較，可以看出，153Sm-EDTMP在骨骼上的攝取極高，在其它組織中的攝取趨于本底；117Snm-EDTMP的小鼠體內(nèi)分布與153Sm-EDTMP趨勢比較一致，在靶向組織(腦骨和四肢骨)上的濃集率較高，但在肝臟上有一定的濃集，可能是由于有部分膠體形成。

表2 153Sm -EDTMP在小鼠體內(nèi)分布Table 2 Biodistribution of 153Sm -EDTMP in normal mice

注(Note)：n=5

表3 117Snm-EDTMP在小鼠體內(nèi)分布Table 3 Biodistribution of 117Snm-EDTMP in mice

注(Note)：n=5

表4 188Re-EDTMP在小鼠體內(nèi)分布Table 4 Biodistribution of 188Re-EDTMP in mice

注(Note)：n=5

188Re-EDTMP在小鼠體內(nèi)骨攝取率在0.5 h就達到最高值(12.50±0.91)%ID/g，而后下降較快，在48 h時僅為7.13%ID/g，說明188Re-EDTMP的體內(nèi)穩(wěn)定性較差，容易被洗脫；血清除較快，6 h時血液殘余為(0.42±0.14)%ID/g，48 h殘余為(0.05±0.01)%ID/g；藥物主要通過腎排泄，但藥物在腎的攝取仍不是很高，24 h時為(0.71±0.31)%ID/g，為骨攝取的8.93%。

表5列出了幾類配合物在進入小鼠體內(nèi)不同時相下在骨上的攝取率數(shù)據(jù)。從表5可以看出，本工作研究的117Sn(Ⅳ)-EDTMP在靶組織(骨)上的攝取率在相同時相上雖然不及目前臨床應用的153Sm-EDTMP，但平均水平均高于國外正在進行臨床研究的117Sn(Ⅳ)-DTPA，表現(xiàn)出潛在研究的價值。當然，為了減少實驗誤差，117Sn(Ⅳ)-DTPA的數(shù)據(jù)也是通過本次實驗與117Sn(Ⅳ)-EDTMP在相同實驗條件下獲得的，其在小鼠體內(nèi)的分布趨勢與文獻[21]報道一致。

表5 骨上的濃集率Table 5 Bone uptake in mice of various compounds

注(Note)：n=5

3 結(jié) 論

本工作通過合成得到配體EDTMP，制備出標記率較高的117Snm(188Re、153Sm)配合物。3種配合物的體外穩(wěn)定性均較好，屬于親水性配合物。小鼠體內(nèi)分布結(jié)果表明，3種配合物均主要被骨攝取，但是188Re-EDTMP的體內(nèi)穩(wěn)定性較差，容易被洗脫；117Snm-EDTMP的小鼠體內(nèi)分布與153Sm-EDTMP趨勢比較一致，在靶組織(腦骨和四肢骨)上的濃集率較高，表現(xiàn)出可用于骨腫瘤治療的可能性，值得進一步研究，但需要解決膠體形成問題。

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