康 磊，王榮福，*，閆 平，劉 萌，張春麗，于明明，崔永剛，徐小潔

1.北京大學(xué)第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100034；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

自從1998年Andrew Fire和Craig Mello首次證實了雙鏈RNA分子可誘導(dǎo)同源靶向mRNA降解并導(dǎo)致基因沉默的RNA干擾(RNA interference, RNAi)機制后，RNAi技術(shù)已經(jīng)成為基因功能研究和基因治療研究等領(lǐng)域中最熱門的技術(shù)之一。小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)作為RNAi過程中的關(guān)鍵因子，具有強大的基因靶向能力和沉默作用。但是siRNA應(yīng)用于體內(nèi)研究時卻往往由于脫靶效應(yīng)或者轉(zhuǎn)運不良而喪失基因沉默效應(yīng)，因此迫切需要一種針對siRNA分子的體內(nèi)示蹤技術(shù)、特別是體內(nèi)顯像技術(shù)的應(yīng)用[1]。放射性核素示蹤技術(shù)具有安全可靠、探測靈敏、分辨率高等優(yōu)點，尤其在大體動物體內(nèi)顯像較光學(xué)成像方法具有很大優(yōu)勢。構(gòu)建一種針對siRNA分子的放射性核素標(biāo)記方法對于RNA分子體內(nèi)示蹤和RNA反義顯像技術(shù)的發(fā)展具有重要意義，并且結(jié)合siRNA的基因沉默效應(yīng)可與放射性治療聯(lián)合達(dá)到基因干擾與放射治療的雙重效果。

另一方面，RNAi技術(shù)的迅速發(fā)展為提高RNA分子體內(nèi)穩(wěn)定性提供了相關(guān)技術(shù)支持。一直以來RNA分子的不穩(wěn)定性限制了其在反義核酸研究領(lǐng)域的應(yīng)用。但是近年來一些化學(xué)修飾方式已被成功應(yīng)用于提高RNA分子的穩(wěn)定性，包括硫代修飾(phosphorothioate，PS)[2]和2’-甲氧基修飾(2’-O-methyl，2’-OMe)[3]。2’-OMe修飾不但可以提高RNA抵抗多種理化因素和體內(nèi)多種酶的降解作用，而且還能增加RNA分子的體內(nèi)轉(zhuǎn)運能力。本工作采用全程2’-OMe化學(xué)修飾，選擇人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)mRNA為作用靶點的siRNA作為標(biāo)記探針，擬通過偶聯(lián)雙功能螯合劑S-乙酰基-NHS-MAG3(N-hydroxysuccinimidyl derivative of S-Acetyl mercaptoacetyltriglycine)構(gòu)建99Tcm標(biāo)記的siRNA示蹤探針，并對其體外標(biāo)記和活性穩(wěn)定性進行評價，以期將來應(yīng)用于腫瘤反義顯像和治療研究。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

S-乙?；?NHS-MAG3由Hnatowich教授(University of Massachusetts Medical School)提供；N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、氯化亞錫(SnCl2·2H2O)、二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide，DMF)均購于美國Sigma-Aldrich公司；酒石酸鈉、乙酸銨、氫氧化銨等常規(guī)分析純化學(xué)試劑均購于北京化學(xué)試劑公司；99Mo-99Tcm發(fā)生器，北京原子高科技術(shù)股份有限公司；Sephadex G25(細(xì))購于美國GE Amersham公司；焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)購于美國Amresco公司，所有試劑均由DEPC處理過的水配制；肝細(xì)胞肝癌腫瘤細(xì)胞系HepG2，ATCC來源；高糖DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmine 2000、無血清培養(yǎng)基(Opti-MEM I Reduced Serum Medium)、10%胎牛血清、Trizol均購于美國Invitrogen公司；Turbo Script逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒購于原平皓公司；DNA聚合酶購于美國CHIMERx公司；瓊脂糖粉購于法國Biowest公司。

1.2 實驗儀器

NanoDrop-1000紫外分光光度儀，美國Thermo Scientific公司；真空凍干機，美國Thermo Fisher公司；RM905放射性活度儀，中國計量科學(xué)研究院；AXIMA-CFRplus電離飛行質(zhì)譜儀，英國Kratos Analytical公司；新華一號濾紙，北京化學(xué)試劑公司；電泳儀、水平電泳槽，北京六一儀器廠。

2 實驗方法

2.1 siRNA的設(shè)計與合成

本研究中siRNA的干擾靶點選擇hTERT mRNA的第14個外顯子的第3119—3137位核苷酸(19 bp)[4]。反義鏈的5’端連接6碳己基及氨基伯胺結(jié)構(gòu)，作為與MAG3偶聯(lián)的基團，其3’端的2個脫氧胸腺核苷酸d(TT)結(jié)構(gòu)用于提高反義結(jié)合活性。因此反義鏈序列為5’-NH2-(CH2)6-UCCAAACUUGCUGAUGAAAd(TT)-3’。正義鏈序列為5’-UUUCAUCAGCAAGUUUG-GAd(TT) -3’。siRNA雙鏈均由上海GenePharma公司合成，全程2’-甲氧基修飾。合成后進行HPLC純化及RNA變性膠分子量鑒定后以凍干形態(tài)保存于-80 ℃。

2.2 siRNA反義鏈與NHS-MAG3偶聯(lián)反應(yīng)

NHS-MAG3偶聯(lián)構(gòu)建99Tcm-siRNA探針的反應(yīng)路線示于圖1。

取適量凍干反義RNA溶于0.30 mol/L HEPES緩沖液(pH=8.0)中，質(zhì)量濃度達(dá)到10 g/L。在震蕩條件下，將無水DMF新鮮配制的NHS-MAG3溶液加入RNA溶液中，使MAG3/RNA 的最終摩爾比為15∶1，室溫下靜置反應(yīng)1～2 h[5-6]。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)醋酸銨溶液(0.25 mol/L，pH=7.2)洗脫Sephadex G25層析柱(0.7×28 cm)純化后，按照每管0.5 mL依次收集30管。根據(jù)每管洗脫產(chǎn)物在260 nm波長處的吸光度值(A260)，合并RNA峰管后將其真空凍干，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 通過S-乙?；?NHS-MAG3偶聯(lián)的99Tcm標(biāo)記siRNA反應(yīng)路線圖Fig.1 Scheme of synthesis of 99Tcm radiolabeled siRNA via chelator of S-Acetyl-NHS-MAG3

2.3 MAG3-siRNA雙鏈形成

取適量偶聯(lián)與未偶聯(lián)的RNA進行AXIMA-CFRplus 質(zhì)譜分析，檢測其分子量差以確認(rèn)偶聯(lián)產(chǎn)物的正確性，再將偶聯(lián)后的反義鏈和正義鏈退火形成siRNA雙鏈[7]。方法如下：取等量的RNA互補鏈分別溶于退火緩沖液(0.05 mol/L NaCl,10 mmol/L dithiothreitol,10 mmol/L MgCl2,10 mmol/L Tris-Cl,pH=7.5)中，使得質(zhì)量濃度為1 g/L。將二者混勻后90 ℃加熱1 min，再置于37 ℃水浴1 h退火形成雙鏈。RNA退火產(chǎn)物以每管10 μg分裝、凍干，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 99Tcm標(biāo)記反應(yīng)

2.5 標(biāo)記率和放射化學(xué)純度的測定

采用新華一號試紙為固定相、丙酮和生理鹽水為雙展開劑的紙層析法測定標(biāo)記產(chǎn)物的標(biāo)記率和放射化學(xué)純度。

2.6 標(biāo)記穩(wěn)定性分析

將標(biāo)記產(chǎn)物99Tcm-siRNA分別溶于適量體積的生理鹽水和新鮮人血清中，終濃度為0.01 g/L。分別置于室溫和37 ℃條件下，孵育0.5、1、2、3、4、6 h后，分別取樣紙層析法測定其放化純度。

2.7 活性穩(wěn)定性分析

HepG2細(xì)胞常規(guī)37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中。待細(xì)胞密度達(dá)80%左右進行RNA轉(zhuǎn)染操作，具體參照Lipofectmine 2000說明書。在分別轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體、未標(biāo)記的siRNA和99Tcm標(biāo)記的siRNA后48 h收集細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增hTERT和GAPDH mRNA，具體擴增引物與條件參照文獻(xiàn)[8]。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

3 結(jié)果和討論

3.1 siRNA反義鏈與NHS-MAG3的偶聯(lián)反應(yīng)

偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)過Sephadex G25層析柱純化后，使用紫外分光光度儀測定其吸光度值，結(jié)果示于圖2。發(fā)現(xiàn)第7管—第9管和第19管—第21管產(chǎn)物在260 nm處有一定的吸收峰(圖2(a))。但第7管—第9管產(chǎn)物僅在260 nm處測定有吸收峰，且峰值較高，提示該管中含有偶聯(lián)產(chǎn)物MAG3-RNA(圖2(b))。而第19管—第21管的吸收峰主要位于230 nm處，而260 nm處的吸收峰僅為230 nm峰的延續(xù)，提示主要為未偶聯(lián)的游離MAG3離子峰(圖2(c))。

將偶聯(lián)后產(chǎn)物MAG3-RNA與偶聯(lián)前RNA分別進行質(zhì)譜分子量分析，結(jié)果示于圖3。由圖3可知，偶聯(lián)前RNA相對分子質(zhì)量為7 061.4(圖3(a))，偶聯(lián)后MAG3-RNA相對分子質(zhì)量為7 307.1(圖3(b))，偶聯(lián)前后相對分子質(zhì)量差為245.7。對照MAG3基團的理論相對分子量為245.23，可見螯合前后的相對分子質(zhì)量差與理論相符，證實了RNA分子與NHS-MAG3成功偶聯(lián)。NHS-MAG3作為一種雙功能螯合劑，與RNA的5’或3’末端連接的胺基結(jié)合，去除保護巰基的乙?；?，通過轉(zhuǎn)螯合作用與99Tcm螯合被標(biāo)記。其優(yōu)點是標(biāo)記反應(yīng)可以在室溫和中性條件下進行[9]，這種溫和的反應(yīng)條件對防止反應(yīng)體系中的RNA分子降解起到重要作用，且該螯合劑具有標(biāo)記率高、穩(wěn)定性好、脫靶少的優(yōu)勢[10]，有利于體內(nèi)研究應(yīng)用的99Tcm標(biāo)記的RNA探針的構(gòu)建。

圖2 偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G25純化后的紫外分光分析Fig.2 Absorbance analysis of purified products after conjugation (a)——各管在260 nm的吸光度值(Absorbance at 260 nm of all products)，(b)——第8管的吸收峰(Absorbance at 260 nm of tube 8)，(c)——第20管的吸收峰(Absorbance at 260 nm of tube 20)

圖3 偶聯(lián)前(a)、后(b)RNA質(zhì)譜分析Fig.3 MALDITOF-MS analysis of RNAs before (a) and after (b) conjugation

3.2 99Tcm標(biāo)記結(jié)果

表1 使用丙酮和生理鹽水雙展開劑的紙層析檢測結(jié)果Table 1 Paper chromatography with acetone and saline at the mobile phase

3.3 影響99Tcm-siRNA標(biāo)記率的因素

3.3.1反應(yīng)時間對標(biāo)記率的影響 不同反應(yīng)時間對標(biāo)記率(Y)的影響示于圖4。由圖4可知，在使用1 g/L SnCl2·2H2O條件下，99Tcm-siRNA的標(biāo)記率在反應(yīng)1 h內(nèi)隨著反應(yīng)時間的增加，標(biāo)記率顯著提高，由5 min時的38.4%增至1 h時的77.3%；而從1 h到5 h的反應(yīng)時間內(nèi)，隨反應(yīng)時間的延長標(biāo)記率無顯著提高，維持在78%左右。由此可見經(jīng)過1 h的反應(yīng)，RNA分子的99Tcm標(biāo)記已達(dá)到飽和平臺期?？紤]到反應(yīng)時間越長，RNA分子受到理化降解因素的危險就越大，因此本實驗選擇1 h作為最佳標(biāo)記反應(yīng)時間，既保證了高標(biāo)記率，還降低了RNA降解的風(fēng)險。

圖4 不同反應(yīng)時間對標(biāo)記率的影響Fig.4 Effect on the labeling efficiency by different reaction time

3.3.2SnCl2·2H2O用量對標(biāo)記率的影響 在標(biāo)記反應(yīng)中，SnCl2·2H2O主要還原高價99Tcm。siRNA分子通過偶聯(lián)的MAG3與99Tcm核素形成螯合物而被標(biāo)記，但是SnCl2·2H2O過多容易產(chǎn)生過多的锝膠體而降低標(biāo)記率。本研究分別測定不同質(zhì)量濃度的SnCl2·2H2O(1、2、4、8、10 g/L)在1 h反應(yīng)時間中的標(biāo)記率，以期優(yōu)化反應(yīng)條件，結(jié)果示于圖5。由圖5可知，反應(yīng)標(biāo)記率在SnCl2·2H2O質(zhì)量濃度為1、2 g/L時均可達(dá)較高水平(77.3%和78.0%)，而當(dāng)SnCl2·2H2O使用量增大時，標(biāo)記率迅速下降至67.7%，此結(jié)果和預(yù)期相符，亦和以往針對寡核苷酸的99Tcm標(biāo)記SnCl2·2H2O使用量[12]一致。

圖5 SnCl2·2H2O的質(zhì)量濃度對標(biāo)記率的影響Fig.5 Effect on the labeling efficiency by different mass concentrations of SnCl2·2H2O

3.4 標(biāo)記產(chǎn)物穩(wěn)定性分析

圖6顯示99Tcm-siRNA探針在生理鹽水和人新鮮血清2種介質(zhì)中孵育6 h均能保持良好的穩(wěn)定性，放化純度(RCP)維持在94%以上。99Tcm-siRNA的放化純穩(wěn)定性在血清與生理鹽水中、37 ℃和室溫下均無顯著性差異，說明經(jīng)過2’-OMe化學(xué)修飾的RNA探針未受到血清中多種酶成分的影響而無降解發(fā)生，且標(biāo)記探針在不同介質(zhì)中均保持良好的標(biāo)記穩(wěn)定性，無脫標(biāo)現(xiàn)象。本實驗中37 ℃下血清介質(zhì)在很大程度上模擬了體內(nèi)環(huán)境，顯示RNA標(biāo)記探針在模擬體內(nèi)環(huán)境中能保持良好穩(wěn)定性，為將來體內(nèi)實驗研究奠定了基礎(chǔ)。以上結(jié)果說明，2’-OMe修飾可在標(biāo)記條件和模擬體內(nèi)環(huán)境下保持RNA分子的穩(wěn)定性，且通過MAG3螯合的99Tcm標(biāo)記的產(chǎn)物能保持良好的標(biāo)記穩(wěn)定性，采用的化學(xué)修飾和標(biāo)記方法適用于RNA探針。

圖6 99Tcm-siRNA探針的體外穩(wěn)定性Fig.6 Stability of 99Tcm-siRNA in vitro生理鹽水(Saline)：▲——室溫(RT)，×——37 ℃；人新鮮血清(Serum)：◆——室溫(RT)，■——37 ℃

3.5 活性穩(wěn)定性分析

經(jīng)過化學(xué)修飾及偶聯(lián)標(biāo)記的siRNA分子是否能夠保持靶向識別能力和干擾活性是評價標(biāo)記方法是否得當(dāng)?shù)闹匾獦?biāo)準(zhǔn)。99Tcm-siRNA探針對hTERT靶向mRNA的干擾作用示于圖7。本實驗分別測定未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、僅有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染未偶聯(lián)標(biāo)記siRNA的細(xì)胞及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染偶聯(lián)標(biāo)記siRNA的細(xì)胞的hTERT基因mRNA水平。由圖7可知，偶聯(lián)標(biāo)記后的siRNA與未偶聯(lián)的siRNA分子具備相似的靶向基因干擾活性((79.2±1.5)%與(81.4±0.5)%))。這一結(jié)果證實所采用的MAG3偶聯(lián)的99Tcm標(biāo)記方法對siRNA分子的生物活性影響很小，保證了siRNA分子的靶向識別特異性和干擾活性。這種活性穩(wěn)定性可能與MAG3基團的分子結(jié)構(gòu)簡單、分子量小因而對RNA分子功能區(qū)影響小有關(guān)。

圖7 99Tcm-siRNA探針對hTERT靶向mRNA的干擾Fig.7 Inhibition activity on hTERT mRNA of 99Tcm-siRNA1——未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Cells without transfection)，2——脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(Cells transfected with liposome)，3——脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染未偶聯(lián)標(biāo)記siRNA的細(xì)胞(Cells transfected with liposome and unlabeled siRNA)，4——脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染偶聯(lián)標(biāo)記siRNA后的細(xì)胞(Cells transfected with liposome and labeled siRNA)

4 結(jié) 論

(1) 通過雙功能螯合劑NHS-MAG3偶聯(lián)的siRNA可被放射性同位素99Tcm標(biāo)記，并獲得較理想的標(biāo)記率、穩(wěn)定的放化純和較高的比活度，此標(biāo)記方法為RNA放射性核素標(biāo)記研究提供了選擇。

(2) 經(jīng)過2’-甲氧基修飾的RNA分子在模擬體內(nèi)環(huán)境中保持良好的標(biāo)記穩(wěn)定性，為RNA標(biāo)記探針進一步在體內(nèi)研究的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

(3) 通過螯合劑NHS-MAG3偶聯(lián)的99Tcm標(biāo)記方法能夠保持RNA分子的生物活性穩(wěn)定性，確保了標(biāo)記RNA探針的靶向特異性，利于將來在體內(nèi)顯像示蹤的應(yīng)用。

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