朱益民,劉志明,歷成杰,白衛(wèi)兵

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科,南寧 530021)

let-7a在胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達(dá)及其對(duì)人胃癌細(xì)胞凋亡的影響

朱益民#,劉志明△,歷成杰,白衛(wèi)兵

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科,南寧 530021)

目的研究let-7a在胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達(dá)及l(fā)et-7a在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響。方法原位雜交法檢測組織芯片上11例正常胃黏膜、17例慢性萎縮性胃炎、52例胃癌組織中l(wèi)et-7a的表達(dá),分析三者陽性率及表達(dá)強(qiáng)度差異性。并將let-7a用重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入人胃癌SGC-7901細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測let-7a對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果(1)let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的陽性表達(dá)率分別為90.9%、88.2%、82.7%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而表達(dá)強(qiáng)度隨著胃黏膜癌變的演進(jìn)逐漸減弱,采用有序分組資料的線性趨勢檢驗(yàn)分析(P＜0.05)。(2)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡分析顯示,let-7a對(duì)SGC-7901的凋亡有明顯的促進(jìn)作用(P＜0.01)。結(jié)論let-7a表達(dá)的減弱與胃黏膜癌變演進(jìn)過程相關(guān);let-7a能夠促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的凋亡,提示let-7a能有效抑制胃癌細(xì)胞。

miRNA;胃癌;組織微陣列;原位雜交;凋亡

微小RNA(micro RNA,miRNA)普遍存在于多細(xì)胞生物中,約占整個(gè)基因組基因總數(shù)2%左右[1]。miRNA是一種內(nèi)源性的、小的、非編碼RNA分子,長約22個(gè)核苷酸,調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的翻譯,并已被證實(shí)參與和調(diào)控了包括時(shí)序發(fā)育、細(xì)胞凋亡、脂肪代謝、神經(jīng)元發(fā)育、細(xì)胞分化、激素分泌等在內(nèi)的多種生理過程。2001年才認(rèn)識(shí)到miRNA兼有腫瘤抑制基因和癌基因的功能,在腫瘤的診斷和預(yù)后中miRNA可以補(bǔ)充其他基因組和蛋白組的生物標(biāo)記[2-3]。lethal-7(let-7)是較早被發(fā)現(xiàn)的有腫瘤抑制作用的miRNA,let-7是其家族中的一員。慢性萎縮性胃炎是公認(rèn)的癌前病變,本研究利用組織微陣列結(jié)合原位雜交技術(shù)檢測let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎及胃癌組織中的表達(dá),分析let-7a在3種組織中陽性表達(dá)率的差異性及其表達(dá)強(qiáng)度與正常胃黏膜→慢性萎縮性胃炎→胃癌這一病變演進(jìn)過程的關(guān)系。本科還從正常組織中克隆let-7a全長基因,并將其連接到了慢病毒載體(Lentiviral vector),利用重組慢病毒將let-7a轉(zhuǎn)導(dǎo)入胃癌SGC-7901細(xì)胞,研究轉(zhuǎn)基因前后SGC-7901細(xì)胞凋亡率的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織、細(xì)胞及質(zhì)粒來源 所使用的組織芯片是陜西超英生物科技有限公司產(chǎn)品,芯片代碼為CC01-01-08,含80個(gè)組織點(diǎn),排列成8行10列,點(diǎn)樣直徑1.5 mm,其中正常胃黏膜11個(gè)點(diǎn)、慢性萎縮性胃炎(伴非典型性增生)17個(gè)點(diǎn)、胃癌52個(gè)點(diǎn)(腺癌42例、鱗癌8例、印戒細(xì)胞癌2例)。同時(shí)收集各種組織的一般臨床資料。正常胃黏膜標(biāo)本中男9例、女2例,平均年齡58歲;慢性萎縮胃炎標(biāo)本中男12例、女5例,平均年齡58.5歲;胃癌標(biāo)本中男41例、女11例,平均年齡57.8歲。人胚胎腎上皮細(xì)胞293 T、人胃癌細(xì)胞系SGC-7901均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。質(zhì)粒 Pwpxl-MOD2、pRsv-REV、pMDlgpRRE、pMD2G由上海交通大學(xué)劉天津博士惠贈(zèng);let-7a表達(dá)質(zhì)粒Pwpxl-MOD2-let-7a由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 試劑盒、酶、試劑及引物來源 let-7a探針購自丹麥Exoqin公司,抗地高辛-辣根過氧化物酶復(fù)合物檢測試劑盒(Anti-Digoxigenin-POD,Fab fi-agrnents)購于Roche公司;let-7a特異性寡核苷酸引物由上海生物工程技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成,上游引物序列 AGGATCCAAAGGTGGTGGTAAGAGGGTGAT,下游引物序列 AGTCGACATAAGACAAGAAGCAAAAGGT TT。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購于美國Gibco公司?？俁NA提取試劑T rizol購于Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega公司。限制性內(nèi)切酶、Real-Time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。T4連接酶購自TOYOBO公司,DNA抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司,AnnexinV/PI試劑盒購自南京凱基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 原位雜交檢測let-7a在組織微陣列中的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)方法:4 μ m厚的組織微陣列切片脫蠟,PBS/DEPC水洗后,經(jīng) 10 mg/L胃蛋白酶K 37℃消化28 min,過梯度乙醇(70%～80%-95%～100%)室溫涼干,0.2 mol/L HCI于37℃反應(yīng)20～30 min增加組織通透性,4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS溶解)室溫條件下固定10 min,0.1 mol/L TEA緩沖液Ⅰ[0.1 mol/L三乙醇胺與乙酸酐混合液,濃度0.25%(體積比)]和T EA緩沖液Ⅱ[0.1 mol/L三乙醇胺與乙酸酐混合液,濃度0.5%(體積比)]雜交前處理以增加組織陽性雜交的強(qiáng)度。雜交:探針Has-let-7a用雜交液稀釋至20 nmol,滴加于組織芯片上,39～45℃水浴鍋內(nèi)雜交18 h。雜交后用TBS溶液沖洗3次,每次10 min,封閉液封閉25 min(封閉非特異的抗體結(jié)合位點(diǎn))。雜交后采用 Anti-Digoxigenin-POD檢測地高辛探針與 miRNA結(jié)合復(fù)合物,TSA放大系統(tǒng)增強(qiáng)原位雜交反應(yīng)的陽性信號(hào),NBT/BCIP顯色,顯微鏡下控制顯色反應(yīng),加核快紅復(fù)染3 min,中性樹膠封片。

陽性對(duì)照和陰性對(duì)照:看家基因β-actin的寡核苷酸探針作為每次雜交的陽性對(duì)照,不加探針的預(yù)雜交液作每次實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照。結(jié)果判斷:光學(xué)顯微鏡下對(duì)let-7a在組織微陣列切片中每一組織點(diǎn)的表達(dá)行綜合觀察判斷。(1)根據(jù)陽性染色強(qiáng)度判斷:細(xì)胞無染色為0分;細(xì)胞呈淺藍(lán)色記1分;細(xì)胞染成藍(lán)色并無背景染色,為中等陽性,記2分;細(xì)胞呈紫色,無背景著色,為強(qiáng)陽性,記3分。(2)根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分:無陽性細(xì)胞計(jì)0分;陽性細(xì)胞數(shù)小于或等于30%計(jì)1分;30%～70%計(jì)2分;陽性細(xì)胞數(shù)70%以上計(jì)3分。取兩種計(jì)分結(jié)果的乘積,0分為陰性,1、2、3、4、6、9分為陽性,其中 1、2 分計(jì)作 ±,3、4 分計(jì)作+,6分計(jì)作++,9分計(jì)作+++。

1.2.2 重組慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 用磷酸鈣沉淀法將Pwpxl-MOD2-let-7a、pRsv-REV、pM Dlg-pRRE、pMD2G 共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T,獲得攜帶目的基因 let-7a和綠色熒光蛋白(GFP)基因的重組病毒,同時(shí)共轉(zhuǎn)染 Pwpxl-MOD2、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G進(jìn)另一組293T作為陰性對(duì)照。按文獻(xiàn)[7]方法獲取重組慢病毒后用它們分別感染胃癌SGC-7901細(xì)胞系,分別獲得過表達(dá) let-7a的 SGC-7901-Pwpxl-MOD2-let-7a細(xì)胞株(實(shí)驗(yàn)組)和轉(zhuǎn)染了空載體(僅表達(dá)GFP)的SGC-7901-Pwpxl-MOD2細(xì)胞株(陰性對(duì)照組),親代SGC-7901細(xì)胞作為本實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照組。

1.2.3 胃癌細(xì)胞株let-7a基因表達(dá)檢測

1.2.3.1 重組慢病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的檢測 重組病毒感染48 h后,將培養(yǎng)皿放在熒光顯微鏡下,觀察有綠色熒光的細(xì)胞數(shù),判斷感染的效率。同時(shí)可用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測GFP陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù),驗(yàn)證慢病毒感染效率(轉(zhuǎn)基因效率)。

1.2.3.2 采用實(shí)時(shí)定量PCR(qReal time-PCR)檢測3組細(xì)胞中目的基因的表達(dá) 重組病毒感染細(xì)胞72 h后收集靶細(xì)胞,按TrIzol Reagent說明書的步驟,抽提各組細(xì)胞的 Total RNA,并利用 ReverTra Ace-αFirst Strand cDNA Synthesis Kit,經(jīng)RT-PCR生成相應(yīng)的cDNA,逆轉(zhuǎn)錄引物:oligodT和let-7aPRT:GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA ACT A,經(jīng) RT-PCR生成相應(yīng)的cDNA,以各組cDNA作為模板,利用兩步法進(jìn)行qReal time-PCR(qReal time-PCR儀為:Eppendorf RealPlex4,Eppendorf Co,LTD)。采用20μ L反應(yīng)體系,SYBR Green熒光染料10 μ L,10 μ mol/L 的引物1 μ L,cDNA 5 μ L,H2O 4μ L 。 反應(yīng)條件:退火溫度為54℃,延伸溫度為45℃,共40個(gè)循環(huán),讀取Ct(Cycle threshold)值。據(jù)相對(duì)定量法(mRNA的相對(duì)變化量公式Ratio=2-△△Ct)計(jì)算目標(biāo)片段的擴(kuò)增比例。各樣本重復(fù)3次,以18S RNA作為內(nèi)參?？瞻讓?duì)照組以同樣的方法作檢測。

1.3 let-7a對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡影響的體外實(shí)驗(yàn) 一式三份4×105個(gè)對(duì)數(shù)生長期的實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組細(xì)胞分別培養(yǎng)在6孔的培養(yǎng)平板中,37℃孵育過夜,按AnnexinV/PI試劑盒說明進(jìn)行凋亡檢測,AnnexinV(+)、PI(-)判斷為早期凋亡細(xì)胞;AnnexinV(+)、PI(+)為晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞;AnnexinV(-)、PI(-)為成活細(xì)胞;AnnexinV(-)、PI(+)為損傷細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件中的χ2檢驗(yàn)分析let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中陽性表達(dá)率的差異性;采用有序分組資料的線性趨勢檢驗(yàn)(Chi-Square and Correlations Test)分析 let-7a在3種組織中的表達(dá)強(qiáng)度與正常胃黏膜→慢性萎縮性胃炎→胃癌這一病變演進(jìn)過程的關(guān)系,計(jì)量資料用±s表示,采用SPSS10.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的原位表達(dá) 在正常胃組織黏膜上皮細(xì)胞漿、核及腺體細(xì)胞漿、核有陽性染色。在炎性組織及增生組織中,增生的黏膜上皮細(xì)胞核、腺體細(xì)胞核、漿均有著色,部分淋巴細(xì)胞亦有著色。在胃癌組織中以癌細(xì)胞胞漿著色為主,部分癌細(xì)胞核亦有著色。陰性對(duì)照:背景干凈,無藍(lán)紫色著色;陽性對(duì)照:非特異性著色少,背景清晰。let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的原位表達(dá)的結(jié)果見表1、插頁Ⅰ圖1。let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織原位表達(dá)中的陽性率分別為90.9%、88.2%、82.7%。采用χ2檢驗(yàn)分析比較發(fā)現(xiàn) let-7a在3種組織中的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 let-7a表達(dá)強(qiáng)度與胃黏膜癌病變演進(jìn)的關(guān)系 let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的原位表達(dá)強(qiáng)度經(jīng)采用有序分組資料的線性趨勢檢驗(yàn),P=0.008。let-7a在胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度呈線性關(guān)系,即隨著胃黏膜癌變的演進(jìn),let-7a在胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度逐漸消減。

2.3 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的檢測結(jié)果 重組慢病毒感染靶細(xì)胞48 h后,放在熒光顯微鏡下幾乎100%細(xì)胞表達(dá)GFP,FCM檢測靶細(xì)胞GFP表達(dá),其陽性率達(dá)98%以上。

2.4 采用qReal time-PCR檢測3組細(xì)胞中l(wèi)et-7a的表達(dá)結(jié)果qReal time-PCR檢測各樣本:將實(shí)驗(yàn)組、空載體組、空白對(duì)照組細(xì)胞采用Real Time PCR檢測后,讀取各組的Ct值。△△Ct=〔Ct(實(shí)驗(yàn)組 let-7a)-Ct(實(shí)驗(yàn)組18S RNA)〕-〔Ct(空白對(duì)照組 let-7a)-Ct(空白對(duì)照組 18S RNA)〕,然后用2-△△Ct計(jì)算,表示實(shí)驗(yàn)組let-7a基因的表達(dá)與空白對(duì)照組的相對(duì)變化倍數(shù),同法計(jì)算空載體組let-7a基因的表達(dá)與空白對(duì)照組的相對(duì)變化倍數(shù)。重組慢病毒介導(dǎo)的Pwpxl-MOD2-let-7a轉(zhuǎn)導(dǎo)入胃癌SGC-7901細(xì)胞后,let-7a的表達(dá)量明顯增高;而陰性對(duì)照組(重組慢病毒介導(dǎo)的Pwpxl-MOD2轉(zhuǎn)導(dǎo)入胃癌SGC-7901細(xì)胞)和親代的胃癌SGC-7901細(xì)胞檢測到的 let-7a的表達(dá)水平相對(duì)較低,見圖2。

圖2 Real time-PCR檢測SGC-7901轉(zhuǎn)染let-7a后表達(dá)量的變化

表1 let-7a在胃黏膜癌病變演進(jìn)組織芯片上原位雜交的表達(dá)

2.5 let-7a對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 FCM檢測顯示let-7a對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡有明顯的促進(jìn)作用,轉(zhuǎn)導(dǎo) let-7a的實(shí)驗(yàn)組凋亡率為(12.0±3.1)%,與空白對(duì)照組(1.9±1.0)%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002),而陰性對(duì)照組(2.5±0.7)%與空白對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.0),見圖 3。

圖3 let-7a對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

let-7a是1993年被發(fā)現(xiàn)的第2個(gè) miRNA,成熟 let-7a其長22個(gè)核苷酸高度保守,提示這一片段是其功能的核心。Johnson等[4]研究顯示let-7在肺癌中表達(dá)低于正常肺組織。Takamizawa等[5]報(bào)道人類肺癌中 let-7經(jīng)常減少,并且與術(shù)后生存期顯著相關(guān)。通常石蠟塊包埋的組織中會(huì)丟失部分蛋白/RNA生物標(biāo)記,而miRNA卻因其分子結(jié)構(gòu)短小而不易被RNA酶或機(jī)械分解[6]。miRNA的序列短而雜交親和力弱、特異性差,采用鎖定核苷酸技術(shù)(locked nucleic acid,LNA)可以克服此缺陷[7]。本實(shí)驗(yàn)采用組織芯片加鎖定核苷酸的探針作原位雜交收到了滿意的效果。本實(shí)驗(yàn)中l(wèi)et-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎和胃癌組織中的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,有可能是因本實(shí)驗(yàn)所采用的組織芯片所包含的正常胃黏膜樣本量太小而影響統(tǒng)計(jì)的結(jié)果。分析比較let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度,本研究結(jié)果顯示,隨著胃黏膜癌變的演進(jìn),其表達(dá)強(qiáng)度逐漸減弱,即 let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達(dá)逐漸遞減。提示let-7a在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的表達(dá)變化是一個(gè)量變過程,而非質(zhì)變。由于胃癌組織塊包含腫瘤細(xì)胞和不少的非腫瘤細(xì)胞,實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(realtime qRT-PCR)檢測雖有定量優(yōu)勢,其結(jié)果未能完全反映出胃癌細(xì)胞中的 let-7a表達(dá)情況,原位雜交檢測胃癌中l(wèi)et-7a,可以更直觀地顯示出腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況,是了解miRNA時(shí)序性和組織特異性表達(dá)更有效的方法。

在本研究中,重組病毒載體基因轉(zhuǎn)移方法具有極高的轉(zhuǎn)染效果,經(jīng)2個(gè)循環(huán)的感染,幾乎可使100%的靶細(xì)胞獲得目的基因,通過熒光顯微鏡直接觀察有否GFP表達(dá)從而間接知道靶細(xì)胞是否被轉(zhuǎn)染和表達(dá)let-7a。本體外研究顯示,let-7a能夠顯著增加SGC-7901細(xì)胞的凋亡率。細(xì)胞凋亡是受基因控制的,是細(xì)胞主動(dòng)參與其自身有序的生理死亡過程,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤的主要途徑[8]。提示let-7a有抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901生長的抗腫瘤作用。

[1]Berezikov E,Guryev V,Vande Belt J,et al.Phylogenetic shadowing and computational identification of human microRNA genes[J].Cell,2005,120(1):21.

[2]Cho WC.Contribution of oncoproteomics to cancer biomarker discovery[J].Mol Cancer,2007,6:25.

[3]Cho WC,Cheng CH.Oncoproteomics:current trends and future perspectives[J].Expert Rev Proteomics,2007,4:401.

[4]Johnson SM,Grosshans H,Shingara J,et al.RAS is regulated by the let-7 microRNA family[J].Cell,2005,120:635.

[5]Takamizawa J,Konishi H,Yanagisawa K,et al.Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival[J].Cancer Res,2004,64:3753.

[6]Lorenzo F,Sempere,Christensen M,et al.Altered micro RNA expression confined to specific epithelial cell subpopulations in breast cancer[J].Cancer Res,2007,67(24):11615.

[7]Kloosterman WP,Wienholds E,Bruijn E,et al.In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA 2 modified oligonucleotide probes[J].Nat Methods,2006,3(1):27.

[8]鄧碧,葉琳,王馳,等.脂質(zhì)體阿霉素誘導(dǎo)人喉癌HEP-2細(xì)胞株凋亡的研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2009,38(18):2318.

Study of in situ expression of let-7a in the gastric mucosa cancerization tissue array and the effect of let-7a on apoptosis of human gastric carcinoma cell line

Z HU Yi-min#,LIU Zhi-ming△,LI Cheng-jie,etal.
(Department of General Surgery,The First A f filiated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)

ObjectiveTo investigate the expression of let-7a micro RNA in the human gastric mucosa cancerization progression tissue array,and study the effects of the let-7a on apoptosis in human gastric carcinoma cell lines.MethodsSitu hybridization was used to detect the expression of let-7a in gastric mucosa cancerization progression tissue microarray containing 11 cases of normal gastric tissue,17 cases of chronic atrophic gastritis(atypical hyperplasia)and 52 cases of gastric carcinoma.The let-7a was transferred to the human gastric carcinoma cell lines SGC-7901 by recombinant lentiviruses which carrying let-7a and cells apoptosis were analysised for the infected cells by flow cytometry(FCM).Results(1)The positive cases of let-7a expression in normal gastric tissue,chronic atrophic gastritis and gastric carcinoma were 10,15,and 43 respectively.There was no significant difference of positive rate among the three groups.However,the degrees of let-7a expression in the groups were closely related to the progression of gastric mucosa cancerization.(2)Flow cytometry based cell apoptosis assays showed that overexpression of let-7a could increase apoptosis in SGC-7901 cells(P＜0.01).ConclusionThe decrease of let-7a is related to progression of gastric mucosa cancerization.let-7a can promote apopotosis in SGC-7901 cells.It suggests that let-7a can effectively inhibit gastric carcinoma.

miRNA;gastric carcinoma;tissue microaray;situ hybridization;apoptosis

R735.2;R730.54

A

1671-8348(2010)08-0921-03

#廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院在讀博士生?！? class="emphasis_bold">通訊作者,

,電話:13152663170;E-mail:zym330422@163.com。

2009-11-07

2009-12-03)

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