岳艷，胡林昆，徐薇，熊思東

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院免疫生物學(xué)研究所，上海 200032

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一種臨床常見的心血管系統(tǒng)疾病，近年來在全球范圍內(nèi)發(fā)病呈上升趨勢(shì)，且已成為青少年不明原因猝死的主要原因之一[1]。柯薩奇病毒B3型(coxsackievirus B3，CVB3)感染是導(dǎo)致人類急、慢性心肌炎和擴(kuò)張性心肌病的重要原因[2]，對(duì)其預(yù)防性和治療性疫苗研制的需求極為迫切。我們的前期工作表明，以具良好生物可容性，促黏膜黏附、吸收及安全無毒等多重優(yōu)良特性的脫乙酰殼多糖chitosan包裹編碼CVB3結(jié)構(gòu)蛋白VP1的質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1，可制備新型chitosan-DNA(chi-pVP1)黏膜疫苗。該疫苗通過滴鼻免疫可誘導(dǎo)較高水平的CVB3特異性血清IgG和糞便IgA，以及較強(qiáng)的全身細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)應(yīng)答，可保護(hù)33.3%小鼠抵抗致死性CVB3的攻擊[3]。為進(jìn)一步增強(qiáng)chi-pVP1誘導(dǎo)的黏膜免疫應(yīng)答，本研究擬從調(diào)節(jié)黏膜局部微環(huán)境、增加免疫細(xì)胞數(shù)量及功能方面入手，以期獲得更有效的免疫保護(hù)力。

趨化因子是一大類具有趨引免疫細(xì)胞〔特別是抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)及T細(xì)胞〕到達(dá)組織局部﹑發(fā)揮炎性功能的重要分子群體，其功能研究和應(yīng)用一直是免疫學(xué)的研究熱點(diǎn)[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子除具有經(jīng)典的趨化功能外，尚具有抗血管生成，促進(jìn)淋巴細(xì)胞發(fā)育和成熟，以及調(diào)節(jié)局部免疫微環(huán)境、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答偏移等多重功效[7]，作為免疫佐劑已廣泛應(yīng)用于抗感染及腫瘤疫苗等諸多領(lǐng)域[8,9]。C家族趨化因子的唯一成員——淋巴細(xì)胞趨化因子(lymphotactin，LTN)主要由活化的CD8+T細(xì)胞和自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞分泌。此外，上皮內(nèi)γδT細(xì)胞、CD4-CD8-T細(xì)胞、CD4+NK1.1+T細(xì)胞也可表達(dá)LTN。由于其主要趨化T細(xì)胞和NK細(xì)胞，因此被認(rèn)為是淋巴細(xì)胞特異性趨化因子[10]。LTN是腸黏膜分泌的最主要趨化因子，在一定程度上提示其可能參與黏膜免疫應(yīng)答過程。Lillard等將卵清蛋白(ovalbumin，OVA)與LTN蛋白共同滴鼻免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)LTN可同時(shí)促進(jìn)OVA特異性黏膜Th1和Th2細(xì)胞應(yīng)答，顯著增高黏膜分泌型免疫球蛋白A(secreting immunoglobulin A，SIgA)水平，顯示其作為黏膜免疫佐劑的良好潛能[11]。然而，目前對(duì)于LTN能否增強(qiáng)黏膜CTL功能尚不清楚。為此，本研究在原有疫苗體系中引入LTN，利用其趨引免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)局部免疫微環(huán)境、促進(jìn)Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答等諸多作用來增強(qiáng)chi-pVP1誘導(dǎo)的特異性黏膜免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)效力。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠肌酸激酶(creatine kinase，CK)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，chitosan(390×103)購(gòu)自Sigma公司。BALB/c小鼠辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)-羊抗小鼠IgG、IgM購(gòu)自美國(guó)Southern Bio公司。CVB4 VP1237～24913肽及CVB3 VP11～1515肽由上海吉爾生化有限公司合成。亮抑酶肽(leupeptin)、抑肽酶(aprotinin)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)及羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5,6-carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester, CFSE)購(gòu)自Sigma公司。雄性BALB/c小鼠， 6周齡，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)飼養(yǎng)。CVB3 Nancy株由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院衛(wèi)生部病毒性心臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊英珍教授提供，在HeLa 細(xì)胞中繁殖和擴(kuò)增，分裝后置-70 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1chi-(pVP1+pLTN)疫苗的制備首先將50 μg pVP1(400 μg/ml)與50 μg pLTN (400 μg/ml)混合，采用復(fù)合物共沉淀法，然后在55 ℃水浴中，將0.02% pH 5.7的chitosan溶液逐滴滴入質(zhì)粒DNA溶液中，同時(shí)高速振蕩20 s，即可形成均一、略帶混濁的chi-(pVP1+pLTN) 復(fù)合物。

1.2.2免疫小鼠及樣品收集將6周齡BALB/c雄鼠分為chi-(pVP1+pLTN)組、chi-(pVP1+pcDNA3.1)組和chi-pcDNA3.1組，每組6只。輕度麻醉下，將疫苗溶液滴入小鼠鼻孔，免疫劑量為每次各質(zhì)粒50 μg，隔周免疫，共4次。收集免疫第8周小鼠血清和糞便樣品。小鼠糞便以100 mg/ml溶解于磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)(5%脫脂牛奶、10 mmol/L leupeptin、1 μg/ml aprotinin、1 mmol/L PMSF)，充分混勻后離心，收集上清液，凍存于-70 ℃。

1.2.3血清IgG及糞便IgA的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)檢測(cè)以10 μg/ml VP1237～24913肽包板，4 ℃過夜；PBST(PBS & Tween-20)洗3遍，以1% 牛血清白蛋白(bovine serum album，BSA)-PBS封閉，37 ℃放置2 h；洗3遍，加入100 μ1 1∶40稀釋血清及糞便原液，37 ℃放置2 h；洗3遍，加入100 μ1 HRP-羊抗小鼠IgG、IgA，37 ℃放置1 h；洗4遍，加入100 μ1 鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)底物，避光顯色7 min，加50 μ1 H2SO4(1 mol/L)終止，測(cè)A490值。

圖1 免疫小鼠第8周誘生的CVB3特異性血清IgG及糞便IgA水平 Fig.1 The levels of CVB3-specific serum IgG and fecal IgA in immunized mice induced at week 8

1.2.4免疫小鼠腸系膜淋巴結(jié)特異性CTL檢測(cè)制備正常BALB/c小鼠脾細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至5×106個(gè)/ml，分2份。一份加入CVB3 VP11～15肽(終濃度20 μg/ml)， 37 ℃孵育2 h，然后在室溫下用高濃度CFSE(5 μmol/L)標(biāo)記；另一份未荷肽的淋巴細(xì)胞用低濃度CFSE(0.5 μmol/L)標(biāo)記，作為體內(nèi)對(duì)照。洗滌后，從2組中各取1×107個(gè)細(xì)胞，混合后重懸于0.5 ml PBS中，經(jīng)尾靜脈分別注入各組小鼠體內(nèi)，18 h后取腸系膜淋巴結(jié)行流式細(xì)胞術(shù)(fluorescence activated cell sorting , FACS)檢測(cè)。

1.2.5CVB3感染及心肌組織病理學(xué)觀察調(diào)整CVB3劑量為3 LD50/0.1 ml，于末次免疫后2周腹腔注射各免疫組小鼠。7 d后取心臟組織行固定、包埋、切片及HE染色，觀察心肌炎癥浸潤(rùn)及壞死情況，并對(duì)其嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)。+：損傷累及范圍<25%；++：損傷累及范圍25%～50%；+++：損傷累及范圍51%～75%；++++：損傷累及范圍>75%。

1.2.6血清CK活性測(cè)定取CVB3感染7 d后免疫小鼠血清20 μl，用定磷法分析測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.5軟件處理，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 chi-(pVP1+pLTN)誘生的CVB3特異性抗體免疫應(yīng)答

以含每種質(zhì)粒50 μg的chi-(pVP1+pLTN)、chi-(pVP1+pcDNA3.1)和chi-pcDNA3.1于0、2、4、6周滴鼻免疫小鼠，收集第8周血清及糞便樣品。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，chi-(pVP1+pLTN)疫苗誘生高水平的血清特異性IgG和糞便IgA，A值分別達(dá)0.66和0.62，顯著高于chi-(pVP1+pcDNA3.1)組的0.58和0.48，提示LTN共滴鼻免疫不僅可提高全身IgG抗體應(yīng)答水平，還可增加腸道局部 IgA的產(chǎn)生(圖1)。

2.2 chi-(pVP1+pLTN)誘生的腸系膜淋巴結(jié)特異性CTL應(yīng)答

在體內(nèi)應(yīng)用CTL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)chi-(pVP1+pLTN)誘導(dǎo)的CVB3特異性CTL功能。于末次免疫后2周，經(jīng)尾靜脈注射1∶1混合的荷VP11～15和未荷VP11～15肽段的靶細(xì)胞，18 h后取小鼠腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)行FACS檢測(cè)。結(jié)果顯示，chi-(pVP1+pLTN)組誘生的特異性殺傷率達(dá)(67.5±7.3)%，顯著高于chi-(pVP1+pcDNA3.1)組的(45.9±4.3)%(P<0.05)，提示LTN共免疫可增強(qiáng)胃腸道黏膜特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答(圖2)。

圖2chi-(pVP1+pLTN)誘生的腸系膜淋巴結(jié)特異性CTL活性

Fig.2CTLactivityinmesentericlymphnodeinducedbychi-(pVP1+pLTN)

2.3 免疫小鼠心肌病理學(xué)觀察

雄性BALB/c小鼠經(jīng)chi-(pVP1+pLTN)疫苗隔周滴鼻免疫，共4次，于末次免疫后2周，以3 LD50/0.1 ml CVB3經(jīng)腹腔感染小鼠。7 d后以心肌組織形態(tài)特征和病理分級(jí)作為評(píng)價(jià)心肌炎嚴(yán)重程度的指標(biāo)進(jìn)行評(píng)判。結(jié)果顯示，chi-pcDNA3.1組小鼠心室內(nèi)、外壁均出現(xiàn)大量嚴(yán)重的灶性壞死，大量心肌細(xì)胞被破壞，代之以成團(tuán)的炎性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌壞死性損傷比較嚴(yán)重 (表1、圖3)。chi-(pVP1+pcDNA3.1)組小鼠心肌壞死性損傷較輕，心肌實(shí)質(zhì)中僅見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死灶，炎癥灶多集中于心內(nèi)膜下，范圍較大。chi-(pVP1+pLTN)組小鼠心肌損傷最輕，其中僅1只小鼠心內(nèi)膜下可見少量炎癥病灶且程度較輕；其余5只心肌完全正常，除有細(xì)胞濁腫現(xiàn)象和少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)外，無明顯異常，近似于正常心肌細(xì)胞。結(jié)果提示，chi-(pVP1+pLTN)新型疫苗滴鼻免疫可有效預(yù)防病毒性心肌炎。

表1各免疫組小鼠病毒性心肌炎病理分級(jí)

Tab.1Pathologicalgradingofviralmyocarditisinmicereceivingvariousvaccines

Group++++++++++Chi-(pVP1+pLTN)1/60/60/60/6Chi-(pVP1+pcDNA3.1)0/62/60/60/6Chi-pcDNA3.10/61/62/63/6

圖3 3 LD50/0.1 ml CVB3感染7 d時(shí)免疫小鼠心肌組織的病理學(xué)觀察Fig.3 Histopathological observation of myocardial tissue from immunized mice at day 7 following 3 LD50/0.1 ml CVB3 infection

2.4 血清CK活性檢測(cè)及心肌炎發(fā)病情況

為進(jìn)一步觀察chi-(pVP1+pLTN)疫苗的免疫保護(hù)效果，我們統(tǒng)計(jì)CVB3感染7 d后各組小鼠心肌炎的發(fā)病率，并檢測(cè)血清CK活性。結(jié)果顯示，chi-pcDNA3.1組小鼠100%出現(xiàn)病毒性心肌炎，血清CK活性顯著升高(371 u/ml)，提示有嚴(yán)重的心肌細(xì)胞損傷；chi-(pVP1+pcDNA3.1)組發(fā)病率為33.3%，血清CK活性為125 u/ml，心肌損傷程度較chi-pcDNA3.1組明顯減輕，提示chi-(pVP1+pcDNA3.1)具有一定的免疫保護(hù)效果；而chi-(pVP1+pLTN)組僅有16.7%小鼠出現(xiàn)心肌炎，血清CK值也最低，僅為54 u/ml，心肌受損范圍最小，程度最輕，提示pLTN共免疫可增強(qiáng)chi-pVP1基因疫苗的免疫保護(hù)效果，更有效地預(yù)防病毒性心肌炎的發(fā)生(表2、圖4)。

3 討論

黏膜是機(jī)體抗感染的第1道防線，同時(shí)也是諸多病原體〔如人類免疫缺陷病毒(human immuno-deficiency virus，HIV)、結(jié)核分枝桿菌、流行性感冒病毒H5N1等〕入侵的主要門戶。倘若機(jī)體不能誘導(dǎo)有效的黏膜免疫應(yīng)答，病原體會(huì)迅速擴(kuò)散入血，進(jìn)而侵犯全身，造成機(jī)體損傷；同時(shí)易發(fā)展為慢性感染，導(dǎo)致嚴(yán)重致死性疾病。因此如何誘導(dǎo)有效的黏膜局部免疫應(yīng)答成為近年來免疫學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題，也成為疫苗研制的重要方向和策略[12-14]。研究證實(shí)，黏膜途徑給予抗原是誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答最有效的手段。我們前期研究設(shè)計(jì)的chi-pVP1通過滴鼻免疫可誘生較高水平的黏膜IgA和脾臟CTL應(yīng)答，具有一定的預(yù)防CVB3感染及病毒性心肌炎發(fā)生的效果。本研究在原有的chi-pVP1疫苗體系中，引入C家族趨化因子LTN，以期增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答，更有效地預(yù)防病毒性心肌炎的發(fā)生。

圖4 3 LD50/0.1 ml 劑量CVB3感染7 d時(shí)免疫小鼠血清CK水平Fig.4 The levels of serum CK in immunized mice at day 7 following 3 LD50/0.1 ml CVB3 infection

表2各免疫組小鼠病毒性心肌炎發(fā)生率

Tab.2Incidenceofviralmyocarditisinmicereceivingvariousvaccines

GroupTotal number of miceNumber of diseased miceIncidence (%)Chi-(pVP1+pLTN)6116.7Chi-(pVP1+pcDNA3.1)6233.3Chi-pcDNA3.166100

本研究發(fā)現(xiàn)，pLTN滴鼻共免疫可顯著提高chi-pVP1誘導(dǎo)的特異性糞便IgA水平，可能是由于LTN誘導(dǎo)黏膜局部免疫應(yīng)答偏離，促進(jìn)Th1和Th2型細(xì)胞因子分泌。一方面白細(xì)胞介素 4(interleukin 4，IL-4)、IL-6等細(xì)胞因子促進(jìn)抗體類別轉(zhuǎn)換，促進(jìn)IgA的產(chǎn)生；另一方面，LTN可能通過上調(diào)黏膜上皮細(xì)胞膜上IgA受體pIgR的表達(dá)，促進(jìn)IgA轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。SIgA是黏膜局部重要的免疫效應(yīng)分子之一，不僅可通過中和作用阻止細(xì)菌、病毒等在黏膜局部附著、定植及入侵，還可通過抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用及調(diào)理吞噬作用清除已進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)和局部組織的病原體，對(duì)抵御病原體感染極為關(guān)鍵[15]。因此，誘導(dǎo)高水平的IgA是黏膜疫苗設(shè)計(jì)的重要目標(biāo)之一。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)滴鼻給予pLTN可增強(qiáng)遠(yuǎn)端黏膜淋巴組織腸系膜淋巴結(jié)的CTL功能。以往研究顯示，用LTN修飾腫瘤疫苗后可上調(diào)瘤體局部IL-2、γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)，促進(jìn)特異性CTL免疫應(yīng)答[16]；更有學(xué)者提出，LTN屬于Th1型趨化因子[17]。我們的工作證實(shí)了上述LTN增強(qiáng)CTL功能的觀點(diǎn)和結(jié)果，但與以往報(bào)道不同的是，本研究將其佐劑效應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)展到黏膜CTL應(yīng)答的誘導(dǎo)中，即黏膜途徑給予LTN DNA質(zhì)?？纱龠M(jìn)黏膜局部淋巴細(xì)胞的殺傷功能，這一結(jié)果為增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答提供了一種新思路。

由于chi-(pVP1+pLTN)疫苗顯著增強(qiáng)CVB3特異性黏膜免疫應(yīng)答，有效清除病毒，成功抵抗CVB3的攻擊，因此僅有16.7%的小鼠出現(xiàn)心肌炎癥狀，且心肌損傷程度極輕。與chi-(pVP1+pcDNA3.1)組33.3%的小鼠出現(xiàn)病毒性心肌炎、心內(nèi)膜下有較多炎癥浸潤(rùn)等相比，具有顯著差異，提示chi-(pVP1+pLTN)提供了更為有效的免疫保護(hù)效果，能更好地預(yù)防病毒性心肌炎的發(fā)生。本研究為柯薩奇病毒疫苗的研制、LTN作為黏膜疫苗佐劑的進(jìn)一步探討提供了有意義的基礎(chǔ)。

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