宋志剛，田棣，張小楠，任廣旭,2，周志統(tǒng)，何靜，袁正宏,2，胡蕓文

1. 上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心，上海201508； 2. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200032

2009年春夏之際，一種新型H1N1甲型流行性感冒(簡(jiǎn)稱流感)在全球流行。此流行始于墨西哥，迅速傳播到美國(guó)、加拿大等北美國(guó)家，之后引起全球范圍內(nèi)的暴發(fā)。同年5月11日，中國(guó)內(nèi)地確診第1例新型甲型H1N1流感病例。5月24日，上海地區(qū)發(fā)現(xiàn)第1例輸入型甲型H1N1流感病例。該新型病毒含有目前所知的4種甲型流感病毒的基因片段[1]，且全球人群普遍缺乏針對(duì)該病毒的免疫力。

由于大部分甲型H1N1流感癥狀與季節(jié)性流感(H3N2、H2N1等)相似，而且流感病毒易在人群傳播中發(fā)生基因變異，導(dǎo)致抗原性和耐藥性改變，因此需要對(duì)甲型H1N1流感病毒進(jìn)行病原學(xué)的嚴(yán)密監(jiān)測(cè)。本研究從上海地區(qū)較早發(fā)現(xiàn)的2例輸入型甲型H1N1流感病例中分離并鑒定了2株病毒株，探討其基因特點(diǎn)和生物學(xué)特征，為上海地區(qū)開展病毒監(jiān)測(cè)和科研工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 患者及樣本收集

2例輸入型甲型H1N1流感患者，其中1例男性患者于2009年5月24日確診為甲型H1N1流感，另1例女性患者于2009年5月29日確診為甲型H1N1流感，均住院治療?；颊叩呐R床癥狀和體征見表1。2例患者均接受奧司他韋(oseltamivir)治療，每日2次，每次75 mg，共服藥5 d，1周后康復(fù)出院?；颊咦≡浩陂g，每日早晨取鼻咽拭子，放入病毒維持液內(nèi)，制成標(biāo)本懸液，立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒檢測(cè)。

1.2 病毒分離培養(yǎng)

2例患者的咽拭子標(biāo)本懸液800 μl分別接種至單層犬腎細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney cell，MDCK細(xì)胞)上，37 ℃孵育30 min，再補(bǔ)入8 ml DMEM培養(yǎng)液(含100 u/ml 青霉素、100 μg/ml鏈霉素和3 μg/ml TPCK-胰酶)，37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)，并每隔3～5 d取培養(yǎng)上清液傳代。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)可識(shí)別的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)時(shí)，用實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的病毒核酸。用終點(diǎn)法滴定計(jì)算每0.1 ml培養(yǎng)上清液中的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50% tissue culture infective dose，TCID50)。

表12例甲型H1N1流感患者的資料和癥狀

Tab.1CharacteristicsandsymptomsoftwopatientsconfirmedasinfluenzaA(H1N1)

CharacteristicPatient 1Patient 2 Age 3022GenderMaleFemaleRecent history of travel to epidemic areasMelbourne (Australia)New York (USA)ProfessionBusinessmanStudentClinical symptoms Fever39.2 ℃38.2 ℃ CoughYesYes Sore throatYesYes DiarrheaNoNo VomitingNoNoHospitalizationYesYesInfiltration on chest radiographNoNoAdmitted to intensive care unitNoNoRespiratory failure requiring mechanical ventilationNoNoOseltamivir treatmentYesYesFull recoveryYesYesVaccinated with influenza vaccine during 2008-2009NoNo

1.3 RNA提取和實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)

用QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen)提取樣本中病毒RNA，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。取樣本140 μl，加入含Carrier RNA的裂解液560 μl，室溫放置10 min；加入560 μl乙醇后混勻，用柱子吸附RNA，依次加入緩沖液AW1和AW2洗滌2次；最后用60 μl AVE緩沖液溶解RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。按美?guó)疾病預(yù)防控制中心推薦的方法進(jìn)行甲型H1N1流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)。參考世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)流感檢測(cè)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)引物 (http://www.who.int/csr/ resources/ publications/ swineflu/ realtimeptpcr/en/ index.html)。用一步實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR體系[2](Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step Quantitative Kit)鑒定該流感病毒，反應(yīng)條件為50 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，在延伸過(guò)程中采集熒光信號(hào)。

1.4 免疫熒光檢測(cè)

在培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)皿中放入蓋玻片，24 h后接種病毒，37 ℃、5% CO2孵育72 h；3%聚合甲醛室溫固定10 min，并用0.1% Triton X-100穿膜。一抗來(lái)自甲型流感患者恢復(fù)期血清，二抗為藻紅素標(biāo)記的抗人IgG(P8047，Sigma，1∶200稀釋)或FITC標(biāo)記的抗人IgG。細(xì)胞與抗體孵育后，在Olympus FV1000共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和熒光。

1.5 電子顯微鏡下觀察病毒

收集培養(yǎng)流感病毒的MDCK細(xì)胞液，置-80 ℃凍存2 h，37 ℃ 融化，反復(fù)凍融3次。取凍融液10 ml，1 600g離心10 min，去沉淀物。上清液以130 000g離心90 min，去上清液。沉淀物重懸后滴在有支持膜的網(wǎng)上，負(fù)染緩沖液(含2%的2.5 mmol/L磷鎢酸，pH 7.0)染色2 min，掃描透射電子顯微鏡(Philips CM20)成像。

1.6 核酸測(cè)序

一步法RT-PCR[2]擴(kuò)增病毒基因組的8個(gè)基因片段并測(cè)序。擴(kuò)增引物參考文獻(xiàn)報(bào)道[1]。采用ABI 3730XL測(cè)序系統(tǒng)(Applied Biosystems)測(cè)序，軟件VECTOR NTI version 8.0整理測(cè)序數(shù)據(jù)，以A/Carifonia/04/2009(H1N1)全長(zhǎng)基因序列作為參考序列。

1.7 系統(tǒng)發(fā)生樹分析

將分離到的2株病毒全基因序列與來(lái)自人甲型流感和豬流感的代表性毒株(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)進(jìn)行對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。系統(tǒng)發(fā)生樹的繪制采用鄰位連接法(neighbor-joining)和最大組成似然模型(maximum composite likelihood)法。發(fā)生樹的可靠性通過(guò)1 000 replications的bootstrap驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)病毒

取2例流感患者的鼻咽拭子標(biāo)本懸液，在入院第1、2天檢測(cè)病毒核酸，結(jié)果均為陽(yáng)性；但從第3天起直至出院，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.2 病毒分離

取2例流感患者鼻咽拭子標(biāo)本懸液，分別接種至MDCK細(xì)胞，連續(xù)傳3代后，可觀察到細(xì)胞變圓、聚集和從壁上脫離等細(xì)胞病變效應(yīng)(圖1B、C)。實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測(cè)到培養(yǎng)上清液中存在病毒顆粒。分別命名病毒株為A/Shanghai/37T/2009(H1N1) 和 A/Shanghai/71T/2009(H1N1)，以下簡(jiǎn)稱37T和71T。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒滴度分別為3 200 TCID50/ml和2 545 TCID50/ml。

2.3 免疫熒光檢測(cè)確認(rèn)細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制

用免疫熒光染色法對(duì)細(xì)胞染色，共聚焦顯微鏡下可見未感染病毒的MDCK細(xì)胞中無(wú)熒光，如圖2A、B所示。病毒感染72 h后的MDCK細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光，呈清晰點(diǎn)狀分布，如圖2C、D所示。

A: Uninfected control monolayers after 72 h. B, C: Infected monolayers 48 and 72 h after inoculation, respectively.

圖137T株感染MDCK細(xì)胞的病變效應(yīng)(×40)

Fig.1Cytopathiceffectinducedby37TinMDCKcells(×40)

A：Uninfected MDCK cells. B：Immunofluorescence imaging of uninfected MDCK cells. C：MDCK cells infected by influenza A virus subtype H1N1. D：Immunofluorescence imaging of MDCK cells infected by influenza A virus subtype H1N1.

圖2免疫熒光染色和共聚焦分析

Fig.2Immunofluorescencestainingandconfocalmicroscopyanalysis

2.4 電子顯微鏡觀察病毒顆粒形態(tài)

37T毒株的掃描透射電子顯微鏡照片顯示，該病毒呈球狀，有包膜，顆粒直徑60～80 nm，包膜表面有突起圍繞，呈現(xiàn)正黏病毒顆粒形態(tài)特征(圖3)。

Scale bar, 200 nm.

圖3掃描透射電子顯微鏡下的病毒顆粒

Fig.3Transmissionelectronmicrographofnegativelystainedviralparticlesshowingtypicalorthomyxovirusparticleswitharegularfringeofsurfaceprojection

2.5 病毒核酸序列和氨基酸序列分析

分別對(duì)37T和71T毒株的全部8個(gè)基因片段(包括PB1、PB2、PA、HA、NA、NS、NP和M基因)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，并在GenBank中注冊(cè)。37T的8個(gè)基因片段的GenBank編號(hào)分別是GQ253489、GQ253490、GQ253491、GQ253492、GQ253493、GQ253494、GQ253495和GQ253496。71T 的8個(gè)基因片段的GenBank編號(hào)分別是GQ253497、GQ253498、GQ253499、GQ253500、GQ253501、GQ253502、GQ253503 和GQ253504。對(duì)比37T和71T的全基因核酸序列與參考株A/California/04/2009(H1N1)的序列，同源性分別為99.79%和99.81%，各基因片段序列與A/California/04/2009(H1N1)株也具有高度的同源性(表2)，與輸入型甲型流感的判斷吻合。

表2上海分離株與參考株核酸序列的相似度

Tab.2Nucleotidesequencesimilarityof37Tand71TcomparedwithreferencestrainA/California/04/2009(H1N1)

GeneRangeA/Shanghai/37T/2009(H1N1)A/Shanghai/71T/2009(H1N1)PB21-228099.78%(5)99.82%(4)PB11-227499.91%(2)99.91%(4)PA1-215199.91%(2)99.91%(2)HA1-170199.59%(7)99.71%(5)NA1-141099.79%(3)99.79%(3)NS1-83899.62%(3)99.88%(1)NP1-149799.80%(3)99.80%(3)M1-97299.80%(2)99.80%(2)

The data in the parenthesis mean the number of nucleotide differences.

將2株病毒的氨基酸序列與參考株序列進(jìn)行對(duì)比，同源性分別為99.75%和99.77%。其中 PB1和M蛋白沒(méi)有氨基酸差異，但PB2、PA、HA、NA、NP、NS1和NS2蛋白的氨基酸序列分別有11個(gè)(37T)和10個(gè)(71T)氨基酸差別(表3)。

進(jìn)一步對(duì)耐藥相關(guān)位點(diǎn)氨基酸(金剛烷胺和奧司他韋)的分析表明，37T和71T病毒株與參考株的耐藥位點(diǎn)氨基酸相同，即M2蛋白氨基酸序列中,金剛烷胺類藥物的耐藥位點(diǎn)第31位[3]由敏感型的絲氨酸(S)突變?yōu)榭顾幮偷奶於０?N)，而NA蛋白氨基酸序列與奧司他韋作用相關(guān)的第119、152、275、293和295位點(diǎn)氨基酸殘基分別為谷氨酸(E)、精氨酸(R)、組氨酸(H)、精氨酸和天冬酰胺，未發(fā)生點(diǎn)突變。

表3上海分離株與參考株的氨基酸突變

Tab.3Aminoacidmutationsamongthereferencestrain,37Tand71T

Viral proteinAmino acid siteA/California/04/2009(H1N1)A/Shanghai/37T/2009(H1N1)A/Shanghai/71T/2009(H1N1)PB2703RRKPA224PSSHA100PSS214TAA220STT338IVV428VIVNA106VII248NDNNP100VIINS1123IVVNS273RKK

2.6 系統(tǒng)發(fā)生樹分析

用HA、NA 和PB2的核苷酸序列分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果顯示，37T和71T的HA基因與典型的豬流感病毒位于同一簇內(nèi)，具有較近的親緣關(guān)系，與人季節(jié)性H1N1流感病毒和歐亞系豬流感病毒的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4A)；而NA基因與歐亞系(禽樣)豬流感病毒位于同一簇內(nèi)，具有較近的親緣關(guān)系，與人季節(jié)性H1N1流感病毒和經(jīng)典豬流感病毒的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4B)；PB2基因與豬H1N2、H3N2和人H1N1位于同一簇內(nèi)，具有較近的親緣關(guān)系，但與人季節(jié)性H1N1流感病毒、經(jīng)典豬流感病毒和歐亞系豬流感病毒的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4C)。

3 討論

2009甲型H1N1流感疫情在北美暴發(fā)后的幾個(gè)月內(nèi)，中國(guó)大部分省市包括北京、廣東和上海等均陸續(xù)出現(xiàn)確診病例。本研究從2例上海確診的甲型H1N1流感患者體內(nèi)，成功分離到2株病毒(37T和71T)。在電子顯微鏡下呈球狀，有包膜，直徑60～80 nm，包膜表面有突起圍繞，基本符合流感病毒的特征。進(jìn)一步的免疫熒光結(jié)果顯示，病毒存在于MDCK細(xì)胞質(zhì)中；核酸檢測(cè)結(jié)果顯示該病毒可能是甲型H1N1病毒。

目前有兩類抗流感病毒的藥物[4]：一類是抑制M2蛋白的藥物，如金剛烷胺；另一類是神經(jīng)氨酸酶抑制劑類，如奧司他韋[5]。奧司他韋對(duì)甲和乙型流感病毒均有效，且臨床不良反應(yīng)小。一般來(lái)說(shuō)，季節(jié)性甲型H1N1流感對(duì)金剛烷胺敏感；而2009甲型H1N1流感對(duì)金剛烷胺耐藥，其M2蛋白氨基酸序列中，耐藥位點(diǎn)第31位[3]由敏感型的絲氨酸突變?yōu)榭顾幮偷奶於０贰?本研究中37T和71T病毒基因測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金剛烷胺耐藥位點(diǎn)有改變，奧司他韋敏感性相關(guān)位點(diǎn)[6,7]無(wú)基因突變現(xiàn)象?；颊咴谑褂脢W司他韋治療2 d后，標(biāo)本中病毒核酸即轉(zhuǎn)陰，說(shuō)明該病毒對(duì)奧司他韋敏感。因此，此2株病毒基因型與病例臨床表型是相符的，也與2009甲型H1N1流感病毒的耐藥特征相一致。

本實(shí)驗(yàn)中采用康復(fù)期患者血清作為抗體進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該血清與病毒有較強(qiáng)的反應(yīng)性，提示患者在感染后短期內(nèi)可能產(chǎn)生了2009甲型H1N1流感病毒的IgG抗體。另一種可能的解釋是，2009甲型H1N1流感病毒感染后能激活宿主體內(nèi)針對(duì)既往季節(jié)性流感病毒的記憶性T細(xì)胞，產(chǎn)生的抗體與本次流行株存在交叉反應(yīng)。吳迪[8]等對(duì)HA蛋白的同源建模分析發(fā)現(xiàn)，2009甲型H1N1流感病毒HA1蛋白與人季節(jié)性流感(H3N2)、禽流感病毒和豬流感病毒HA蛋白的同源性達(dá)40%～84%，HA2蛋白與上述流感病毒HA蛋白的同源性達(dá)63%～92%。因此，針對(duì)季節(jié)性流感的抗體與2009甲型H1N1流感病毒起交叉反應(yīng)的推測(cè)有一定的理論依據(jù)，但須通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)發(fā)生樹中，37T和71T病毒的HA、NA、PB2基因分別與典型的豬流感病毒HA基因，歐亞系(禽樣)豬流感病毒NA基因，豬H1N2、H3N2和人H1N1的PB2基因具有較近的親緣關(guān)系，與先前研究報(bào)道[1,9]相似。經(jīng)DNA序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，37T和71T病毒只有很少的核酸發(fā)生突變，從氨基酸序列上未發(fā)現(xiàn)此2株流感病毒與A/California/04/2009(H1N1)參考株在生物學(xué)特性、耐藥性和抗原性方面存在顯著差異，與2009甲型H1N1流感病毒株的研究報(bào)道[10]相符合，表明此2株病毒與2009甲型H1N1流感病毒可能為同一來(lái)源。

與以往季節(jié)性流感相比，流行于 2009年春夏和秋冬季的甲型H1N1流感病毒的傳播性更強(qiáng)，并易在肥胖者、孕婦等特定人群中引起重癥感染[11]。目前，國(guó)內(nèi)、外研究還未能很好解釋上述現(xiàn)象，因此對(duì)2009甲型H1N1流感病毒的生物學(xué)特性仍需繼續(xù)觀察，其重癥發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

A：HA. B: NA. C: PB2.

The phylogenetic trees made from the two isolated strains (▲) and representative selected strains were generated by using MEGA 4.0 with the neighbor-joining method and bootstrap resampling (1 000 replications). The numbers at each branch represent the bootstrap value (below 60% is not shown). The evolutionary distances were computed by using the maximum composite likelihood method and are in the units of the number of base substitutions per site.

圖4上海分離株與相關(guān)參考株的HA、NA、PB2基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹

Fig.4PhylogenetictreesfornucleotidesequencesofHA,NAandPB2genesof37T,71Tandreferencestrains

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