喬可, 王輝, 楊崇廣，羅濤，梅建，高謙

1. 復旦大學上海醫(yī)學院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學分子病毒學重點實驗室，上海 200032; 2. 上海市疾病預防控制中心結核病防治科，上海 200336

結核病的流行及結核分枝桿菌耐藥性的增加，給結核病的預防、控制和治療帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。目前在世界范圍內(nèi)廣泛分布、易引起暴發(fā)流行且與耐藥相關的結核分枝桿菌北京基因型菌株引起了人們極大的關注[1,2]。北京基因型菌株是指具有相似遺傳背景和特異間區(qū)寡核苷酸分型(spoligtyping)指紋圖譜的結核分枝桿菌(缺失1～34間隔區(qū))[2]。根據(jù)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)或長片段多態(tài)性(large-sequence polymorphism，LSP)，目前我國流行的北京基因型菌株可分為多個亞型，且不同亞型之間可能存在耐藥性和傳播力等遺傳性狀的差異[3,4]。因此，深入研究北京基因型菌株微進化并區(qū)分不同亞型，對研究其進化和傳播規(guī)律都具有重要意義。

基于可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(variable number of tandem repeat，VNTR) 的基因分型方法是一種簡單、準確的分子分型手段，由于其分析快速、適用于所有結核分枝桿菌分離株、便于不同實驗室結果比較，現(xiàn)已成為分子流行病學研究的常用手段[5]。近期研究表明，VNTR不僅可用于研究北京基因型菌株的近期傳播，也是研究其微進化的有力工具[6]。根據(jù)基因組NTF區(qū)域是否有IS6110插入，可將北京基因型菌株分為ancient和modern亞型[7,8]。在NTF區(qū)域有1或2個IS6110插入的modern亞型在全球廣泛流行，主要分布于中國、俄羅斯及南非[9-11]。Ancient 亞型以前被稱為N家族，在NTF區(qū)域不具有任何IS6110的插入，往往與人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者免疫力低下相關聯(lián)[12]，但其只占歐亞大陸北京基因型菌株的小部分。Wada等根據(jù)15位點VNTR數(shù)據(jù)，運用最小生成樹(minimum spanning tree, MST)的方法成功將日本的北京基因型菌株劃分為由SNP定義的8個亞型，并發(fā)現(xiàn)日本的菌株全為ancient亞型[13]。

為建立適合我國北京基因型菌株基于VNTR的進化分析法，我們從上海地區(qū)常用的7位點VNTR[14]、日本地區(qū)常用的JATA(12)-VNTR[15]及廣泛應用的15位點VNTR中選取了22個VNTR位點，對上海地區(qū)北京基因型菌株進行分型，同時結合SNP基因分型結果，通過構建MST尋找適合研究北京基因型菌株微進化的VNTR組合及區(qū)分不同亞型的分子標志。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

結核分枝桿菌臨床分離株來自于上海市疾病預防控制中心保存的上海崇明島地區(qū)痰培養(yǎng)陽性患者就診時收集的菌株。

1.2 主要儀器及試劑

主要儀器及試劑：基因擴增儀(美國Applied Biosystems公司和Bio-Rad公司)、2×Taq PCR MasterMix(北京天根生物技術有限公司)、凝膠成像儀(Bio-Rad公司)和Quantity One分析軟件(Bio-Rad公司)。

1.3 北京基因型菌株鑒定

參照Chen等的方法[16]。

1.4 VNTR基因分型

QUB15、7位點VNTR(VNTR3820、QUB18、QUB11a、QUB11b、MIRU26、Mtub21、 QUB26)及15位點VNTR(QUB11b、MIRU16、MIRU26、Mtub21、Mtub30、ETRA、ETRC、MIRU10、MIRU31、MIRU40、MIRU04、QUB4156、Mtub04、Mtub39、QUB26)的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)引物及條件分別與Kwara、Le Flèche及Smittipat等的實驗相同[17-19]，VNTR2074、VNTR2372、QUB3336的PCR引物及條件與Murase等的實驗相同[20]。引物由上海Invitrogen公司合成。VNTR分型參照Zhang等的方法[14]。

1.5 SNP基因分型

Filliol等提出利用45個SNP位點對世界范圍內(nèi)的結核分枝桿菌進行分型的方法[21]，我們從中選擇只在北京基因型菌株中表現(xiàn)多態(tài)性的位點作為區(qū)分其不同亞型的標準，共9個位點(909166、797736、2825581、1892017、4137829、2376135、2532616、1692069和1477596)。其中1477596位點的PCR反應體系：引物終濃度0.2 μmol/L，2×Taq PCR MasterMix 5 μl，DNA模板1 μl，ddH2O補至10 μl。PCR反應條件：預變性94 ℃ 5 min；94 ℃變性 30 s，61 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，重復20個循環(huán)；終末延伸72 ℃ 7 min。其余位點采用連接酶檢測反應(ligase detection reaction, LDR)分型方法，由上海捷瑞生物工程有限公司協(xié)助操作。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel軟件分析和處理數(shù)據(jù)，BioNumerics軟件構建MST，VNTR位點的分辨率(Hunter-Gaston discriminatory index，HGI)用下述公式計算：

N指總的樣本數(shù)，nj是第j個型別的菌株數(shù)，s是所有型別的數(shù)目[22]。

2 結果

2.1 北京基因型菌株鑒定結果

本研究共獲得175株臨床分離株，經(jīng)鑒定(RD-105)篩選出北京基因型菌株135株?；颊哔Y料及耐藥信息全部由上海市疾病預防控制中心提供，其中男性113例(占83.7%)，女性22例(占16.3%)。年齡18～87歲。

2.2 VNTR與SNP分型結果

為探明不同VNTR位點對北京基因型菌株的分辨能力，本研究利用22個VNTR位點對篩選出的135株北京基因型菌株進行分型，結果見表1。

相對于VNTR，SNP是一種研究進化更精確的工具，VNTR結果必須首先與SNP信息相吻合才具有進化方面的研究價值。為明確適用于研究進化的VNTR組合，本研究首先利用不同VNTR組合構建MST，然后將SNP分出的亞型與MST中的各分支進行比較，觀察兩者是否吻合。SNP分型結果見表2。135株樣本被分為8個序列型(sequence type，ST)，分別為ST26、ST3、ST25、ST19、ST10、ST22、NEW1和NEW2。按照Filliol等的工作[21]，ST26、ST3、ST25和ST19屬ancient菌株，ST10和ST22屬modern菌株，NEW1和NEW2為新分出的型別。SNP單倍型主要集中在ST10(42.2%)、ST19(30.4%)和ST22(14.1%)3個類型。

2.3 構建MST

合適的MST可區(qū)分不同的SNP單倍型，并最大程度區(qū)分不同的菌株。為了尋找適合研究北京基因型菌株微進化的VNTR位點組合，我們利用不同VNTR組合構建北京基因型菌株的MST，再通過SNP的分型結果去驗證其可靠性。MST分型結果見圖1。利用7位點VNTR繪制的MST(圖1A)，SNP單倍型分布散亂，沒有規(guī)律，不能區(qū)分ancient與modern亞型；而利用15位點VNTR所構建的MST(圖1B)，與SNP分型信息基本吻合，但ancient亞型ST相對散亂。分析發(fā)現(xiàn)，7位點VNTR的總分辨率為0.9997，15位點VNTR的總分辨率為0.9879，雖然前者的分辨率高于后者，但后者更適合于研究種系的發(fā)生。由此可見，研究種系發(fā)生時需將高分辨率的位點與低分辨率的位點相結合。

表122個VNTR位點在135株結核分枝桿菌北京基因型菌株中的分辨率

Tab.1HGIof22VNTRlociin135M.tuberculosisstrainsofBeijinggenotype

VNTR aliasNumber of allelesAllelic diversity (HGI)VNTR3820230.925QUB18120.851QUB11a150.767QUB11b70.662QUB26110.633Mtub2170.582QUB415640.550MIRU26110.539QUB1530.490Mtub0440.333QUB333660.259VNTR237250.246MIRU4050.244VNTR207430.205Mtub3950.180ETRA30.178MIRU3170.168MIRU1630.153MIRU1030.152ETRC50.142Mtub3030.086MIRU0430.072

15位點VNTR所構建的MST中，ancient亞型ST相對散亂，這可能是由于某一高分辨率位點的存在引起的。在15位點的基礎上，將HGI>0.5的位點逐一去掉，添加一些低分辨率的位點。結果顯示，去掉MIRU26(HGI>0.5)，添加2個分辨率相對較低的位點VNTR2074、QUB15(HGI<0.5)，基于這樣的16位點所構建的MST(圖1C)能較好區(qū)分不同的SNP單倍型，并最大程度區(qū)分不同的菌株，適用于北京基因型菌株微進化的研究。

表2135株結核分枝桿菌北京基因型菌株的SNP分型結果

Tab.2TheSNPgenotypingresultsof135M.tuberculosisstrainsofBeijinggenotype

Type of sequenceAlleles in indicated SNP position of H37Rv7977362825581189201741378299091661477596237613525326161692069Number of isolates (%)SubfamilyST10TGCTTTAGA57 (42.2)ModernST22TGCTTTGAA19 (14.1)ModernST19TGCTTCAGA41 (30.4)AncientST25TGCTCCAGA1 (0.7)AncientST26CTTCTCAGA10 (7.4)AncientST3TGTCCCAGA1 (0.7)AncientNEW1TGTCTCAGA4 (3.0)AncientNEW2TGTTTCAGA2 (1.5)Modern

MSTs of 135M.tuberculosisstrains of Beijing genotype based on 7-locus-VNTR (A), 15-locus-VNTR (B) and 16-locus-VNTR (C). Each circle means a different type identified by VNTR genotyping, and the size of the circle means quantity of isolate. Heavy lines connecting two VNTR types denote single-locus variant, thin lines imply double-locus variant, and dotted lines (black) imply triple-locus variant. Grayed dotted lines mean variants in more than three loci. Among these isolates, ST10 includes 57 isolates, ST19 includes 41 isolates, ST22 includes 19 isolates, ST26 includes 10 isolates, ST3 includes 1 isolate, ST25 includes 1 isolate, NEW1 includes 4 isolates, and NEW2 includes 2 isolates.

圖1135株結核分枝桿菌北京基因型菌株的MST

Fig.1MSTsof135M.tuberculosisstrainsofBeijinggenotype

2.4 區(qū)分不同亞型/ST的分子標志

在構建MST的過程中，我們找到一些與北京基因型菌株亞型區(qū)分密切相關的VNTR位點(表3)。這些位點與所對應的亞型/ST有很高的相關性，提示很可能是區(qū)分北京基因型菌株不同亞型/ST的分子標志。

表3VNTR位點與各亞型/ST的相關性

Tab.3ThecorrelationofVNTRandsublineage(s)/STs

VNTR locusSpecific alleleCorresponding sublineage(s)/STsSpecificity (%)Mtub213Ancient924Modern96QUB268Modern78MIRU164NEW1100QUB41563Modern974ST261005ST19,NEW198

3 討論

相對于以類群為進化單位的宏進化，微進化是以生物個體作為進化的基本單位，是生物多樣性的來源。VNTR基因分型技術操作簡單，能提供數(shù)字式的分型信息，具有很高的可重復性，已成為非常具有吸引力的結核分枝桿菌指紋圖譜分析的方法[17,23]。近期研究表明，在結核分枝桿菌這個保守性很高的克隆群體中，基于VNTR構建的種系發(fā)生樹(MST)與基于SNP單倍型定義的亞型之間有高度的一致性。與SNP相比，由于VNTR的高變性，基于VNTR的種系發(fā)生樹能反映同一亞型中菌株的微進化特征[24]。

北京基因型菌株在東亞地區(qū)廣泛流行，并且在世界其他地區(qū)暴發(fā)的概率明顯高于其他類型菌株，很多研究都致力于探明其在感染與流行方面的規(guī)律[21,25]。本研究利用22個VNTR位點對135株上海崇明島地區(qū)的北京基因型菌株進行分型并構建MST，發(fā)現(xiàn)16位點VNTR較適合于研究北京基因型菌株的微進化。本研究還發(fā)現(xiàn)，利用MST方法研究微進化，必須選擇一些分辨率高的位點(如QUB11b、QUB26和Mtub21)，同時也要選擇一些進化上相對保守的位點(如ETRC、Mtub30和MIRU04)。選擇7位點VNTR進行菌株基因型分析主要是基于分辨率的高低，而選擇16位點VNTR則是在分辨率與保守性上的折中。

4個VNTR位點(Mtub21、QUB26、MIRU16和QUB4156)與相應北京基因型菌株不同亞型的相關性非常高，提示這些位點可能是區(qū)分不同亞型的分子標志。目前在全球范圍內(nèi)流行的北京基因型菌株大多為modern 菌株[7,11]。近期，日本的Wada等利用15位點VNTR構建MST，表明在日本流行的主要為ancient菌株，來自中國與蒙古的北京基因型菌株都屬于modern菌株[13]。本研究結果顯示，在上海崇明島地區(qū)不僅存在modern菌株，還存在ancient菌株。但本研究所選菌株均來自上海崇明島地區(qū)，由于地域上的局限，流行菌株具有較強的地域性，所得結論是否普遍適用于結核分枝桿菌北京基因型菌株，還需要進一步研究。

總之，本研究結果提示，利用16位點VNTR來研究上海崇明島地區(qū)北京基因型菌株的微進化比較合適，能為北京基因型菌株分子流行病學框架的構建、菌株進化研究和臨床菌株的基因型分析提供幫助。同時4個VNTR位點(Mtub21、QUB26、MIRU16和QUB4156)可能是區(qū)分北京基因型菌株不同亞型的分子標志，這將為研究北京基因型菌株不同亞型的傳播、致病性及毒力因子提供便利。

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