石運(yùn)芝,劉 迅,劉 敏,楊 東

( 1. 泰山醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，山東 泰安 271000；2. 泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院婦科，山東 泰安 271000； 3.泰安市中醫(yī)院制劑科，山東 泰安 271000；)

輸卵管是輸送配子、受精和早期胚胎發(fā)育的重要場所。深入研究圍著床期(peri-implantation)輸卵管特異分子的表達(dá)調(diào)控，是揭示輸卵管與受精卵和早期胚胎的關(guān)系，以及闡明輸卵管妊娠機(jī)制的基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡在女性生殖活動(dòng)中所起的重要作用已得到公認(rèn)，Xu JS等曾報(bào)道，人輸卵管細(xì)胞可維持與其共培養(yǎng)的卵裂期鼠胚線粒體膜電位，抑制Caspase的活性，促進(jìn)鼠胚發(fā)育[1]。黃體生成素受體(luteinizing hormone receptor，LHR)屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族，通過與黃體生成素(luteinizing hormone，LH)結(jié)合，在整個(gè)生殖生理過程中起著十分重要的作用[2-4]。但是有關(guān)凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2和LHR在小鼠輸卵管中的表達(dá)情況以及它們之間是否具有相關(guān)性等，國內(nèi)外報(bào)道甚少，且研究結(jié)果也頗一致。

鑒于此，我們以正常成熟雌性昆明小鼠為研究對象，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)研究了圍著床期輸卵管上皮中LHR、Caspase-3和Bcl-2的分布和變化規(guī)律，并對其可能的生物學(xué)作用和調(diào)節(jié)機(jī)制加以探討，以期為生殖調(diào)控的理論體系提供新的資料。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本制備

健康成熟雌性昆明小鼠28只，體重25～30 g，隨機(jī)分為4組：第1組為動(dòng)情期組，第2組為妊娠第1 d組，第3組為妊娠第4 d組，第4組為妊娠第6 d組，每組7只。正常有生育能力的成熟雄鼠10只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。動(dòng)情周期的劃分以陰道細(xì)胞涂片確定：動(dòng)情期細(xì)胞全部是無核角化上皮細(xì)胞，無白細(xì)胞。妊娠確定：于傍晚將雌性小鼠與雄性小鼠2∶1合籠，次日晨查見陰栓者定為妊娠第1 d。

1.2 SABC法免疫組織化學(xué)染色

將各組小鼠脫頸處死，立即剖腹，解剖鏡下分離出輸卵管，PBS沖洗后，投入4%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟連續(xù)切片，切片厚度為6 μm。切片經(jīng)脫蠟入水，3%H2O2室溫作用10 min，蒸餾水洗；微波抗原修復(fù)2次；5%BSA封閉液，室溫20 min；分別滴加兔抗小鼠LHR(1∶200)、兔抗小鼠Caspase-3(1∶200)和兔抗小鼠Bcl-2(1∶200)，37 ℃孵育2 h；生物素化羊抗兔IgG，37 ℃溫浴30 min；SABC復(fù)合物，37 ℃溫浴30 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。每一組均設(shè)陰性對照，以PBS代替一抗。一抗和SABC免疫組織化學(xué)試劑盒，均購于武漢博士德生物工程公司。

1.3 結(jié)果判定及分析

每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取6張切片，光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)觀察3個(gè)視野，陽性部位呈棕黃色，根據(jù)著色深淺，將著色強(qiáng)度分為強(qiáng)陽性(+++)、陽性(++)、弱陽性(+)和陰性(-)。并將圖像輸入Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)(泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所)，分別測得各實(shí)驗(yàn)組輸卵管上皮中陽性細(xì)胞的平均光密度(OD值)，并繪出直條圖，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 輸卵管上皮中LHR免疫組化染色結(jié)果及圖像分析

各組LHR陽性著色主要見于輸卵管上皮細(xì)胞游離緣，高倍鏡下可見著色部位主要位于細(xì)胞表面的纖毛或微絨毛，部分上皮細(xì)胞內(nèi)亦有陽性著色。在孕1 d，輸卵管的上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽性(+++)著色(圖1)。于孕4 d，上皮著色稍減弱(++)，但仍顯著強(qiáng)于動(dòng)情期和孕6 d組(圖2、3、4)。

2.2 輸卵管上皮中Caspase-3免疫組化染色結(jié)果及圖像分析

光鏡下觀察，Caspase-3免疫陽性產(chǎn)物主要分布于輸卵管上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)。輸卵管上皮細(xì)胞的著色在動(dòng)情期組最強(qiáng)(+++)(圖5)，在孕早期各組的著色呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢，孕4 d降至最低，至孕6 d著色又有所增強(qiáng)(圖6、7、8)。

2.3 輸卵管上皮中Bcl-2免疫組化染色結(jié)果及圖像分析

Bcl-2陽性著色部位與Caspase-3相仿，主要分布于輸卵管上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)。而且Bcl-2的著色與LHR有相似的變化規(guī)律，即孕1 d組上皮著色最深(+++)(圖9)，孕4 d組上皮著色減弱(++)，至孕6 d時(shí)著色(+)已低于動(dòng)情期的水平(++)(圖10、11)。

圖1 孕1 d輸卵管LHR陽性著色。標(biāo)尺示100 μm

圖2 孕4 d輸卵管LHR陽性著色。標(biāo)尺示100 μm

圖3 孕6 d輸卵管LHR陽性著色。 標(biāo)尺示100 μm

圖4 各組小鼠輸卵管上皮LHR水平的變化

圖5 動(dòng)情期輸卵管Caspase-3陽性著色?！?00

圖6 孕4 d輸卵管Caspase-3陽性著色?！?00

圖7 孕6 d輸卵管Caspase-3陽性著色。×200

圖8 各組小鼠輸卵管上皮Caspase-3水平的變化

圖9 孕1 d輸卵管Bcl-2陽性著色?！?00

圖10 孕6 d輸卵管Bcl-2陽性著色?！?00

圖11 各組小鼠輸卵管上皮Bcl-2水平的變化

3 討 論

小鼠輸卵管分傘部、壺腹部、峽部和間質(zhì)部。由于部位不同，黏膜皺襞高低、多少均不同。在輸卵管峽部橫斷面上略呈十字樣的狹小管腔，至壺腹部時(shí)，在橫切面上管腔充滿了縱橫曲折的皺襞，輸卵管傘端切面呈高度樹枝狀。我們根據(jù)皺襞形態(tài)，僅對輸卵管壺腹部和峽部進(jìn)行觀測。壺腹部是精子和卵子受精的場所。峽部是精子獲能、發(fā)生頂體反應(yīng)和貯存的主要部位。另外，小鼠的排卵是自發(fā)排卵(spontaneous ovulation)，排卵時(shí)間為動(dòng)情開始后2～3 h，孕1 d時(shí)受精卵已形成并進(jìn)入輸卵管，大約孕4.5～6 d胚胎進(jìn)入子宮腔并開始著床。

LHR屬于G蛋白耦聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)超家族中的糖蛋白受體亞家族成員，通過與LH結(jié)合而發(fā)揮作用，主要分布于性腺組織(睪丸Leydig細(xì)胞、卵巢顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞)和非性腺組織(子宮、前列腺和乳腺)[5-7]。本實(shí)驗(yàn)表明，LHR主要分布于圍著床期小鼠輸卵管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，這與Zhang M等報(bào)道的LHR在輸卵管上皮陰性表達(dá)不同[8]。Zhang M等在研究中應(yīng)用的是C57BL/6雌鼠，取材時(shí)也未考慮動(dòng)情周期，是否與實(shí)驗(yàn)材料和動(dòng)情周期有關(guān)，有待證實(shí)。我們觀察到，LHR在孕1 d和孕4 d組輸卵管峽部和壺腹部的上皮細(xì)胞著色最強(qiáng)，明顯高于動(dòng)情期和孕6 d組的水平(P﹤0.05)。在動(dòng)情期，排卵前出現(xiàn)LH峰，而此時(shí)輸卵管上皮細(xì)胞LHR的表達(dá)未達(dá)峰值，提示LHR的表達(dá)不僅由LH本身所誘導(dǎo)，還受雌孕激素、hCG等其他因素的調(diào)節(jié)[9-11]。在輸卵管壺腹部LHR的峰值于孕1 d時(shí)出現(xiàn)，而在輸卵管峽部于孕4 d時(shí)出現(xiàn)，這可能與早期胚胎對輸卵管上皮細(xì)胞的局部調(diào)節(jié)有關(guān)。

Caspase-3 是半胱氨酸蛋白酶(Caspase) 家族中的一個(gè)重要成員，作為細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)中一個(gè)主要效應(yīng)因子，參與多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Xu JS等的研究發(fā)現(xiàn)，人輸卵管細(xì)胞可維持與其共培養(yǎng)的卵裂期鼠胚線粒體膜電位，抑制Caspase的活性，促進(jìn)鼠胚發(fā)育[1]。Bcl-2可對多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起抑制作用，使細(xì)胞生存期延長。我們的研究表明，Caspase-3和Bcl-2主要存在于圍著床期小鼠輸卵管上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)，且在輸卵管峽部和壺腹部的上皮細(xì)胞中具有相同的變化規(guī)律，提示它們可能具有相似的調(diào)控機(jī)制。Caspase-3在動(dòng)情期的水平最高，在孕早期呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，孕4 d降至最低，至孕6 d又有所回升。Bcl-2于孕1 d達(dá)到峰值，且在孕1 d和孕4 d的水平明顯高于動(dòng)情期和孕6 d組。提示輸卵管上皮細(xì)胞Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)可能是按照配子和胚胎的需要來進(jìn)行調(diào)節(jié)的，表現(xiàn)為動(dòng)情期(排卵前后)輸卵管上皮細(xì)胞Caspase-3的水平較高，從孕1 d開始，Bcl-2的表達(dá)上調(diào)，Caspase-3的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致輸卵管上皮細(xì)胞對凋亡的抵抗性增強(qiáng)，以促進(jìn)輸卵管上皮細(xì)胞的功能，滿足受精和早期胚胎發(fā)育的需要；孕6 d時(shí)，胚胎已離開輸卵管，此時(shí)Caspase-3的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，輸卵管上皮細(xì)胞的功能減弱。

研究結(jié)果還顯示，LHR和Bcl-2具有相似的變化規(guī)律，即均在孕1 d和孕4 d高表達(dá)，而Caspase-3在孕1 d和孕4 d低表達(dá)。說明LHR、Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)可能具有一定的相關(guān)性。已有研究證實(shí)，Bcl-2可通過抑制Caspase的激活底物如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，而抑制細(xì)胞凋亡，這與本研究中Caspase-3和Bcl-2的反向表達(dá)同時(shí)出現(xiàn)是一致的。Tai P等研究發(fā)現(xiàn)，LH不僅可以促進(jìn)出生后睪丸Leydig細(xì)胞的增殖，而且可以通過激活LHR，經(jīng)ERK1/2 通路抑制Leydig細(xì)胞的凋亡[12～13]。由此我們推測，在孕1 d和孕4 d時(shí)，活化后的LHR可能以相似的機(jī)制導(dǎo)致了輸卵管上皮細(xì)胞的增殖，同時(shí)抑制輸卵管上皮細(xì)胞的凋亡，以增強(qiáng)輸卵管上皮細(xì)胞的功能，促進(jìn)受精和早期胚胎發(fā)育。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，LHR、Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)與圍著床期小鼠輸卵管上皮細(xì)胞的功能密切相關(guān)，并且LHR、Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)可能具有一定的相關(guān)性，可能是由于LHR的活化導(dǎo)致了輸卵管上皮細(xì)胞的增殖，同時(shí)抑制輸卵管上皮細(xì)胞凋亡的結(jié)果。對于LHR活化的原因，LHR調(diào)節(jié)輸卵管上皮細(xì)胞增殖和凋亡的具體機(jī)制，以及這些分子與胚胎和其他調(diào)節(jié)因子的關(guān)系等，還有待進(jìn)一步研究。

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