朱 雪,王 亮

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014； 2.濟(jì)南市第六人民醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250020)

寒冷應(yīng)激過強(qiáng)可使機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性發(fā)生變化，引起機(jī)體的許多異常反應(yīng)，近年國(guó)內(nèi)外對(duì)冷應(yīng)激損傷的免疫及分子機(jī)制研究有了很大進(jìn)展[1-5]，但未見寒冷應(yīng)激條件下脂多糖誘導(dǎo)肺損傷過程中髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO) mRNA表達(dá)水平變化的報(bào)道。MPO是一種重要的含鐵溶酶體，為中性粒細(xì)胞所特有的酶類，能反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及活性[6]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量(200±20 g)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(N)10只，寒冷刺激+脂多糖組(CL)10只，脂多糖組(L)10只。

1.2 主要試劑及儀器

脂多糖(Life Sciences 公司，LOT2011/08)；TAKARA RT-PCR 試劑盒 Version 3.0。PCR儀(PE公司)；PTC-200 Peltier Thermal Cycler；Alpha ImagerTM 2200 凝膠成像系統(tǒng)；Alpha Innotech Corporation；BioRad 電泳儀及電泳槽；DL2000 DNA marker(TAKARA產(chǎn)品)；eppendorf micro spectrophotometer。

1.3 動(dòng)物模型制作

N組：正常飼養(yǎng)(溫度18～20℃)，不作任何處理。CL組：將大鼠置于4℃的自制調(diào)溫箱中飼養(yǎng)4 h，每日一次，連續(xù)刺激4天，分別于第5天、第12天氣管內(nèi)滴入LPS。L組：前4天正常飼養(yǎng)，第5、12天氣管內(nèi)滴入LPS。各組大鼠飼養(yǎng)至第19天時(shí)麻醉后處死，采集肺組織。

氣管內(nèi)滴加脂多糖的方法：大鼠按50 mg/kg體重腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉溶液麻醉，固定于解剖臺(tái)上，頭低位暴露聲門，將16號(hào)靜脈套管針沿氣管走行快速插入氣管，拔出針芯，接1 ml注射器，1秒鐘內(nèi)注入溶于注射用生理鹽水的濃度為1 mg/ml的脂多糖0.2 ml(200 μg)，將大鼠直立，左右旋轉(zhuǎn)，使脂多糖在肺內(nèi)均勻分布。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1動(dòng)物體征觀察

營(yíng)養(yǎng)狀況，被毛光澤度，活動(dòng)能力，飲食，體重，呼吸，有無咳嗽、氣喘，鼻腔分泌物，排泄物性狀。

1.4.2肺組織組織學(xué)觀察

大鼠麻醉后，取右肺組織置于10%中性福爾馬林溶液中充分固定。常規(guī)HE染色，于光學(xué)顯微鏡下攝片觀察組織形態(tài)學(xué)改變。

1.4.3RT-PCR法檢測(cè)肺組織勻漿MPO mRNA表達(dá)水平

采用RT-PCR半定量法檢測(cè)大鼠肺組織MPO mRNA基因表達(dá)。取100 mg 肺組織制備勻漿，兩步法RT-PCR 反應(yīng)檢測(cè)MPO mRNA表達(dá)。1% 瓊脂糖凝膠電泳，Alpha Innotech imager觀察電泳條帶存入圖像。以系統(tǒng)的SPOT DENSITY 軟件分別測(cè)量?jī)?nèi)參照和MPO基因擴(kuò)增條帶的密度，以MPO條帶的密度與內(nèi)參照管家基因的密度比值代表基因表達(dá)的相對(duì)水平。

內(nèi)參照rat β-actin 引物序列：

forward ：5’GAG GGA AAT CGT GCG TGA C 3’

reverse: 5’GGA CTC ATC GTA CTC CTG CTT G 3’

擴(kuò)增產(chǎn)物481bp

MPO引物序列:

Rat-MPO-LP:5’CGC CAG CCC TAT GGA ACT 3’

Rat-MPO-RP:5’GCC ACT GCG ATT GAC CTT 3’

Pdroduct：388 bp

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物體征的變化

N組大鼠暴露皮膚呈淡粉色，毛發(fā)光澤，體重逐漸增加，呼吸平穩(wěn)，便質(zhì)正常。CL組施加寒冷刺激期間，大鼠口唇、四肢末端蒼白，拱背蜷縮，扎堆，寒戰(zhàn)，呼吸急促，噴嚏較多，鼻孔潮濕。L組和CL大鼠滴加脂多糖后出現(xiàn)呼吸急促，有明顯痰鳴音，毛發(fā)干枯無光澤，食量減少，鼻腔分泌物粘稠，有的出現(xiàn)鼻腔出血結(jié)痂，咳嗽頻繁，大便較干燥，色黑。CL組表現(xiàn)更為明顯。

2.2 肺組織組織學(xué)觀察

CL組可見氣管、支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎細(xì)胞群較多，肺泡充血，肺泡出現(xiàn)融合現(xiàn)象。支氣管上皮細(xì)胞脫落，可見較多分泌物，管腔變小，間質(zhì)細(xì)胞變性，間質(zhì)增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，多處小中炎性灶。部分可見肺組織壞死之后形成的空洞。L組可見部分氣管、支氣管及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎細(xì)胞群較多，部分肺泡融合。支氣管內(nèi)可見分泌物，可見間質(zhì)增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.3 RT-PCR半定量法測(cè)定各組大鼠肺組織勻漿中MPO mRNA表達(dá)

表1 RT-PCR半定量法測(cè)定各組大鼠肺組織勻漿中MPO mRNA表達(dá)水平

注：▲與N組比較P<0.01，◆與CL組比較P<0.01。

CL、L組大鼠肺組織勻漿中MPO的表達(dá)與N組比較明顯升高(P<0.01)，且CL組與L組之間相比較也有顯著差異(P<0.01)。

N組： 4×10 10×10 40×10

CL組： 4×10 10×10 40×10

L組： 4×10 10×10 40×10圖1 各組大鼠光鏡下肺組織形態(tài)學(xué)改變

圖2 MPO RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳條帶圖

由左至右：marker CL，L，N(由上至下600bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp)。

3 討 論

髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)是由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和某些組織的巨噬細(xì)胞分泌的含血紅素輔基的血紅素蛋白酶，是血紅素過氧化物酶超家族成員之一[7]。粒細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)之前在骨髓內(nèi)合成MPO并貯存于嗜天青顆粒內(nèi)[8]，外界刺激可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集，MPO釋放。MPO是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細(xì)胞(PMN)的功能和活性狀態(tài)[9]。MPO不僅能殺滅吞噬于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的多種微生物，如腫瘤細(xì)胞、血小板、NK細(xì)胞、原蟲、毒素等，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等多方面發(fā)揮作用。MPO基因多態(tài)性導(dǎo)致個(gè)體對(duì)一些疾病易感性的差異，與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如心肌梗死、白血病、糖尿病、老年癡呆癥[9-12]等等，因此越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。在各種呼吸系統(tǒng)疾病當(dāng)中，如肺癌、支氣管炎、肺炎、哮喘、肺栓塞[13-17]等等，MPO也發(fā)揮著重要作用。

實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，動(dòng)物在冷應(yīng)激時(shí)，對(duì)傳染病的易感性增高。早在19世紀(jì)時(shí)，巴斯德就發(fā)現(xiàn)，浸在冷水中的動(dòng)物，對(duì)炭疽的抵抗力降低。冷應(yīng)激降低動(dòng)物的抵抗力增加傳染病發(fā)病率，如犢牛肺炎，豬流感等。周正任[18]等以4℃寒冷條件刺激小鼠，觀察到反映機(jī)體的非特異性免疫功能的NK細(xì)胞活性和反映機(jī)體特異性細(xì)胞免疫功能的IL-2均降低，說明機(jī)體免疫功能在寒冷條件下呈一過性下降。田中偉[19]等的觀察也說明同樣的結(jié)果，NK和LAK細(xì)胞的活性隨冷暴露的時(shí)間而呈波動(dòng)性變化，最終使機(jī)體的免疫功能降低。

本實(shí)驗(yàn)中觀察到大鼠經(jīng)寒冷刺激后氣管內(nèi)滴加LPS，與沒有經(jīng)過寒冷刺激的大鼠相比較，所造成的肺組織病理損傷更為嚴(yán)重，MPO mRNA表達(dá)水平升高更明顯。因寒冷刺激條件下造成機(jī)體的免疫功能降低，在這種情況下施加細(xì)菌內(nèi)毒素刺激，免疫功能低下者肺部所造成較損傷更嚴(yán)重。MPO mRNA表達(dá)水平升高說明，肺部感染后中性粒細(xì)胞在肺組織內(nèi)聚集增多，中性粒細(xì)胞合成和分泌MPO增多。中性粒細(xì)胞還可激活和釋放大量活性氧，通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞，產(chǎn)生毒性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA，進(jìn)一步破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，從而造成肺組織一系列的病理變化。本實(shí)驗(yàn)的意義在于說明機(jī)體在某些應(yīng)激條件下會(huì)造成免疫功能的降低，而免疫功能的降低則會(huì)使細(xì)菌感染的幾率大大增加，且感染后對(duì)機(jī)體器官、組織的損傷會(huì)較正常機(jī)體嚴(yán)重。反之，應(yīng)激過程中若采用增強(qiáng)白細(xì)胞活性的方法，可減輕應(yīng)激損傷從而維持機(jī)體免疫功能穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)為應(yīng)激免疫學(xué)提供了資料。在臨床上，則要注意應(yīng)激后感染易發(fā)的可能性，并提前采取措施，因?yàn)榇藭r(shí)若合并感染會(huì)給機(jī)體造成更大損傷，也會(huì)增加治療的難度。

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