王艷，史益強(qiáng)，戴琳，于穎

(中國藥科大學(xué)，江蘇南京210009)

大量的研究結(jié)果表明，茄尼醇具有較強(qiáng)的抗癌生物活性，是合成心血管疾病、抗癌、抗?jié)兊人幬锏闹虚g體，可作為合成輔酶Q10［1］和維生素K2的側(cè)鏈，合成二元酸茄尼醇乙酰葡萄糖二酯［2］等抗?jié)兯幬铩⒖拱┧幬锏脑?。在醫(yī)學(xué)上廣泛用于治療充血性心臟病所致浮腫、肺充血、心絞痛，治療急慢性肝炎、亞急性肝壞死，治療壞血病、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、壞死性牙周炎等。

煙葉中提取的茄尼醇含量和純度均較低，必須經(jīng)特種設(shè)備加工處理后去除雜質(zhì)，并將純度提高至90%以上才能作為合成輔酶Q10或維生素K2等藥物的原料。

因此本試驗(yàn)主要探討了高純度茄尼醇的制備工藝，目前一般采用有機(jī)溶劑萃取、多次重結(jié)晶的提純方法，產(chǎn)品中茄尼醇的含量一般只能達(dá)到60%～70%［3］，生產(chǎn)成本也很高。本實(shí)驗(yàn)以煙葉為原料，采用混合溶劑萃取得煙葉浸膏，乙醇溶液稀釋皂化反應(yīng)物，以石油醚萃取茄尼醇，再以乙醇溶解脫蠟、結(jié)晶初步精制，最后經(jīng)大孔樹脂吸附純化得到高純度茄尼醇。改進(jìn)的制備工藝，可以提高效率，節(jié)約能源。

1 主要原料、試劑和儀器設(shè)備

原料:煙葉(產(chǎn)地:遼寧;等級(jí):中等)。

試劑:石油醚(CP);無水乙醇、甲醇(AR);乙醇、甲醇(SP);茄尼醇對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，98%);大孔樹脂(型號(hào):YPR-Ⅱ、D-1300、HZ-816、HZ-802)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備:玻璃儀器;提取設(shè)備;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;真空干燥箱;高速離心機(jī);植物粉碎機(jī)。

檢測(cè)儀器:高效液相色譜儀。

2 方法與結(jié)果分析

2.1 檢測(cè)方法

HPLC測(cè)定:色譜柱為ODS(250 mm×4.6 mm);柱溫為25℃;流動(dòng)相為甲醇-乙醇(25∶75，V/V);檢測(cè)波長:210 nm;流速為1 mL/min。

2.2 初提和皂化工藝

將煙葉去梗后在60℃的烘箱中干燥4 h，粉碎成顆粒狀。稱取預(yù)處理的煙葉25 g裝入500 mL的三口瓶中，加入一定體積混合溶劑，在50℃下加熱3 h，冷卻后抽濾，濾液蒸干回收溶劑，得粗品茄尼醇浸膏。

皂化過程如下:將得到的粗品茄尼醇浸膏，加入一定體積的0.15 mol/L氫氧化鈉的乙醇溶液，在50℃下加熱2 h，冷卻，用稀鹽酸調(diào)pH值約為6～7，等體積石油醚萃取3次，將萃取液蒸干回收溶劑，得茄尼醇浸膏。

本實(shí)驗(yàn)采用混合溶劑乙醇-石油醚對(duì)煙葉中的茄尼醇進(jìn)行提取，并將得到的茄尼醇浸膏溶解，對(duì)其進(jìn)行了皂化反應(yīng)。對(duì)混合溶劑體積比以及料液比進(jìn)行了考察，數(shù)據(jù)見表1、2所示。

表1 混合溶劑體積比對(duì)茄尼醇提取的影響

從表1可知，隨著乙醇體積含量的增加，茄尼醇得率也逐漸增加，而乙醇為提取液進(jìn)行提取時(shí)，其提取量反而減少了，其原因可能是乙醇是極性溶劑，對(duì)植物細(xì)胞有極強(qiáng)的穿透作用，使得植物中的成分易于溶出而被提取出來，導(dǎo)致混合溶劑條件下茄尼醇的提取量更高，而茄尼醇易溶于非極性溶劑，使得提取出的部分茄尼醇溶解在石油醚相，而此時(shí)乙醇相中茄尼醇的量減少，有利于乙醇進(jìn)一步對(duì)植物中的物質(zhì)進(jìn)行提取，達(dá)到動(dòng)態(tài)提取的目的。

表2 料液比對(duì)茄尼醇提取的影響

從表2可以看出，當(dāng)料液比為1∶12(g∶mL)時(shí)，茄尼醇得率可達(dá)到1.24%，料液比增大，茄尼醇成分的提取量變化并不大，反而有減少的趨勢(shì)?？赡艿脑蚴请S著料液比的增大，混合溶劑中乙醇的體積過大，相對(duì)的石油醚體積較少，不利于從乙醇相中萃取茄尼醇，即不能減少乙醇相中的茄尼醇，因此達(dá)不到動(dòng)態(tài)提取的目的。

從表1、2中數(shù)據(jù)可知，皂化是茄尼醇提取過程所必需的關(guān)鍵步驟，茄尼醇通常以游離態(tài)和化合態(tài)兩種形式存在，其中游離態(tài)占主要成分，化合態(tài)一般以脂肪酸脂的形式存在。皂化反應(yīng)能使化合態(tài)的茄尼醇釋放出來，提高茄尼醇的得率，并有助于提高茄尼醇的純度?；旌先軇┎捎靡掖己褪兔演^好，安全且價(jià)格合理;乙醇和石油醚體積比為4∶1，料液比(g∶mL)=1∶12時(shí)，茄尼醇的提取量最多，粗品純度也較高。

2.3 結(jié)晶

將皂化后所得的茄尼醇浸膏加入適量溶劑中溶解，用高速離心機(jī)離心，除去不溶性雜質(zhì)，將得到的溶液放置于－18℃環(huán)境中過夜，抽濾，得到的黃色顆粒狀茄尼醇粗品。實(shí)驗(yàn)對(duì)溶劑、溫度及時(shí)間等做了初步考察，數(shù)據(jù)見表3、4所示。

表3 不同體積的試劑對(duì)茄尼醇溶解性比較

表4 結(jié)晶條件的選擇

顯然選擇乙醇、乙酸乙酯作為茄尼醇的結(jié)晶試劑是比較理想的。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯對(duì)皂化后浸膏溶解較差，而乙醇對(duì)其溶解性較好，并且在最底層的不溶物，經(jīng)檢測(cè)為雜質(zhì)，經(jīng)過濾除去，所以選擇乙醇為茄尼醇的結(jié)晶試劑。

從表4的結(jié)果可知，茄尼醇在－18℃、6 h(過夜)的條件下結(jié)晶效果較好，結(jié)晶茄尼醇收率較好，含量較高。其他條件下結(jié)晶不好的原因可能是溫度較高，茄尼醇析出較少，結(jié)晶物質(zhì)與雜質(zhì)分離不好，因此選擇18℃、6 h(過夜)作為茄尼醇的最佳結(jié)晶條件，可獲得純度為63.4%的茄尼醇。

2.4 大孔樹脂純化

(1)大孔樹脂的前處理與再生［4，5］:取YPR-Ⅱ、D-1300、HZ-816、HZ-802幾種樹脂，經(jīng)乙醇、3%鹽酸、水、5%氫氧化鈉依次再生處理后，水洗至pH中性。(2)樣品溶液制備:取結(jié)晶后茄尼醇粗品1.2 g，溶于2 mL無水乙醇，備用。(3)大孔樹脂型號(hào)確定:精確量取10 mL上述經(jīng)預(yù)處理過的大孔樹脂裝柱(30 mm×1.5 mm)，平行兩根，共分兩次完成該實(shí)驗(yàn)。分別精密吸取茄尼醇樣品液0.4 mL上柱，收集10 mL/份，流速5 mL/h。依次用40%、60%、80%乙醇與無水乙醇各80 mL梯度洗脫，將收集的洗脫液經(jīng)HPLC在線檢測(cè)，將純度大于90%部分合并。(4)大孔樹脂最佳層析容量確定:精確量取10 mL選定的上述經(jīng)預(yù)處理過的大孔樹脂裝柱(30 mm×1.5 mm)，平行3根。分別精密吸取茄尼醇樣品液0.2、0.4與0.6 mL上柱，收集10 mL/份，流速5 mL/h。依次用40%、60%、80%乙醇與無水乙醇各80 mL梯度洗脫，將收集的洗脫液經(jīng)HPLC在線檢測(cè)，將純度大于90%部分合并，減壓蒸餾除去乙醇濃縮得到高純度茄尼醇，確定最佳層析容量。

在進(jìn)行大孔樹脂純化的過程中，上樣的茄尼醇粗品純度達(dá)到60%以上，這大大減少了大孔樹脂吸附純化的時(shí)間，同時(shí)也提高了所得茄尼醇的純度。

大孔吸附樹脂的極性與空間結(jié)構(gòu)(孔徑和比表面積)對(duì)吸附作用的影響較大［6，7］，在樹脂型號(hào)的選擇時(shí)，選用了幾種常見且性質(zhì)相似的大孔吸附樹脂YPR-Ⅱ、D-1300、HZ-816、HZ-802，具體的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)見表5。

4種大孔吸附樹脂都對(duì)茄尼醇有明顯的吸附作用，除去了一些有極性的雜質(zhì)。相同樹脂條件下，無論是不同指標(biāo)成分之間，還是不同濃度的乙醇洗脫液之間，解吸率數(shù)值顯得無規(guī)律可循。不同大孔吸附樹脂解吸附作用總體上看，D-1300、HZ-816、HZ-802這3種樹脂純化的茄尼醇純度可達(dá)到91%，而通過YPR-Ⅱ樹脂純化的茄尼醇純度達(dá)到93.6%以上，優(yōu)于上述3種樹脂。因此，在大孔樹脂最佳層析容量確定時(shí)，我們選用了YPR-Ⅱ進(jìn)行考察，數(shù)據(jù)見表6所示。

表5 吸附樹脂型號(hào)及物理結(jié)構(gòu)參數(shù)

表6 大孔樹脂最佳層析容量

從表6可知，大孔吸附樹脂YPR-Ⅱ的最佳層析容量是15.1 mg/mL。

表7結(jié)果表明，90%茄尼醇主要集中在無水乙醇洗脫液中，占全部洗脫液中總茄尼醇的88.1%，故確定洗脫條件為:用蒸餾水、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇洗去極性雜質(zhì)，再用無水乙醇洗脫，收集無水乙醇洗脫部分，HPLC檢測(cè)含量為93.6%。

表7 不同洗脫液中茄尼醇的含量及收率

3 結(jié)論

3.1 在茄尼醇初提的過程中，采用石油醚-乙醇混合溶劑作為提取劑，體積比為1∶4，料液(g∶mL)比為1∶12時(shí)，為最佳提取條件，不僅提高了茄尼醇的得率，而且提高了茄尼醇浸膏的純度。

3.2 皂化反應(yīng)能使化合態(tài)的茄尼醇釋放出來，提高茄尼醇的得率，并有助于提高茄尼醇的純度。皂化后的茄尼醇的量比皂化前茄尼醇的量增加了約20%左右。

3.3 結(jié)晶時(shí)，結(jié)晶容積選擇乙醇，結(jié)晶條件在－18℃、6 h(過夜)時(shí)結(jié)晶效果較好，結(jié)晶茄尼醇收率較好，含量較高。

3.4 純化時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用了YPR-Ⅱ、D-1300、HZ-816、HZ-802幾種常用大孔樹脂作為分離介質(zhì)，均可將含量為63%左右的茄尼醇粗品純化成含量高達(dá)93.6%以上的茄尼醇，說明YPR-Ⅱ、D-1300、HZ-816、HZ-802這幾種大孔樹脂用來分離純化茄尼醇是可行的。大孔樹脂具有吸附容量大、解吸條件溫和、選擇性好、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用的分離純化茄尼醇的工藝路線、設(shè)備投資少、收率穩(wěn)定，具有良好的應(yīng)用前景。

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