張興旺,陶燕鐸,梅麗娟,邵 赟

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所,青海西寧 810008;2.中國科學(xué)院研究生院,北京 100049)

龍膽花為藏醫(yī)常用品種,分為白花龍膽和雜花龍膽,在臨床上為多品種入藥,具有清濕熱、瀉肝膽實(shí)火、鎮(zhèn)咳、利喉、健胃功能,主治感冒發(fā)燒、目赤咽痛、肺熱咳嗽、胃熱、腦痧、尿道熱、陰癢及陰部濕疹、天花等[1]?！端{(lán)琉璃》云:“邦見按花色不同可分為白色、藍(lán)色和雜色三類?！薄｝埬懟ǔＷ鳛椴爻伤幍木幓虺妓?如龍膽花丸、十五味龍膽丸、三味龍膽丸等。龍膽科植物主要含有的裂環(huán)烯醚萜苷類化學(xué)成分龍膽苦苷、獐牙菜苷等,是龍膽科的苦味成分和活性成分[2]。本實(shí)驗(yàn)首次建立了藏藥 7種龍膽花中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量測定的 HPLC方法,并對它們的含量進(jìn)行了比較,為龍膽花多品種入藥提供科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器與材料

微波實(shí)驗(yàn)儀 (帶回流、磁力攪拌);Agilent 1200LC高效液相色譜儀,G1379A在線脫氣機(jī),G1311A四元泵,G1329A標(biāo)準(zhǔn)型自動進(jìn)樣器,G1316A柱溫箱,Agilent1200色譜工作站,AG204電子分析天平

麻花秦艽 (Gentiana straminea Maxim.)花、達(dá)烏里秦艽 (Gentiana dahuricaFisch.)花、黃管秦艽(Gentiana officinalisH.Smith)花、管花秦艽 (Gentiana siphonanthaMaxim.Ex Kusnez.)花、線性龍膽(Gentiana lawrenceiBurk.)、云霧龍膽 (Gentiana nubigenaEdgew.)花,藍(lán)玉簪龍膽 (Gentiana veitchiorum Hemsl.)花于 2009年 8月采自青海省境內(nèi),均為野生,海拔均在 3 500 m以上,由中國科學(xué)院西北高原生物研究所梅麗娟高級工程師鑒定。

甲醇、磷酸均為分析純,色譜用甲醇為色譜純。龍膽苦苷 (批號為:110770-200308)、購自中國藥品生物制品檢定所,純度大于 98%;獐牙菜苦苷由作者從麻花秦艽中分離得到,經(jīng)歸一化法檢測,純度大于 98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Fusion-RP 80 Ac18柱 (150 mm×4.6 mm,5μm);柱溫:30℃;流動相:甲醇 -0.2%磷酸溶液梯度洗脫 (0～25 min:15%～30%);流速:1 mL/min;檢測波長 240 nm;進(jìn)樣量:5μL。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 對照品 (a)和樣品 (b)HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取獐牙菜苦苷,龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品適量,加甲醇制成 0.105 g·L-1,0.3 g·L-1的溶液 ,搖勻 ,0.45μm的微孔濾膜過濾后作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取龍膽花樣品約 0.5 g,精密稱定,置 250 mL平底燒瓶中,加入 20 mL甲醇,置微波實(shí)驗(yàn)儀中,回流攪拌提取 20 min,冷卻至室溫,濾過,濾液收集到50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,0.45μm微孔濾膜濾過,即得供試品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

分別精密吸取對照品溶液 1,3,5,7,9μL,在上述色譜條件依次進(jìn)樣,以進(jìn)樣量 (X)為橫坐標(biāo),峰面積 (Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程見表1。

2.5 精密度試驗(yàn)

精確吸取對照品溶液 10μL,按 2.1節(jié)色譜條件測定 5次,結(jié)果獐牙菜苦苷,龍膽苦苷峰面積的RSD分別為 1.21%,0.84%,表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取麻花秦艽花約 0.5 g,精密稱定,按 2.3節(jié)方法制備供試品溶液,分別在 0,2,4,6,8,12 h后在上述色譜條件下進(jìn)樣 5μL,結(jié)果獐牙菜苦苷,龍膽苦苷峰面積的 RSD分別為 1.1%,1.54%,表明樣品溶液在 12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取麻花秦艽花約 0.5 g,精密稱定,按上述供試品溶液的制備方法和測定條件,重復(fù)測定 5份,結(jié)果獐牙菜苦苷,龍膽苦苷峰面積的 RSD分別為 1.3%,1.62%,表明重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知獐牙菜苦苷,龍膽苦苷含量的麻花秦艽花樣品 5份,每份約 0.5 g,精密稱定,加入對照品獐牙菜苦苷 1.002 mg,龍膽苦苷 4.012 mg,制備樣品溶液。精密吸取 5μL進(jìn)樣分析,計算平均回收率,結(jié)果見表2。

表2 獐牙菜苦苷,龍膽苦苷加樣回收率

2.9 樣品含量測定

取供試品溶液,過 0.45μm的微孔濾膜,分別進(jìn)樣 5μL,測定 (n=5),取 5次測定的平均值,結(jié)果見表3。

表3 7種龍膽花中獐牙菜苦苷和龍膽苦苷測定結(jié)果

3 討 論

3.1 7種龍膽花中獐牙菜苦苷與龍膽苦苷含量的比較

由表3可以看出,黃管秦艽花中獐牙菜苦苷的含量最高為 0.712%,云霧龍膽花含量最低為0.222%,其他龍膽花介于二者之間。管花秦艽中龍膽苦苷的含量最高為 3.21%,黃管秦艽中的含量最低為 1.60%,本實(shí)驗(yàn)對這 7種龍膽花中 2種主要有效成分的含量進(jìn)行了比較,可為龍膽花多品種入藥提供科學(xué)的依據(jù)。

3.2 不同提取方法的比較

比較了 3種提取法:甲醇加熱回流 30 min;甲醇微波回流 (帶磁力攪拌)20 min和甲醇超聲 30 min。結(jié)果表明:7種藥材微波提取率均大于加熱回流法和超聲法,而且與其他提取方法相比,微波輔助提取法具有提取時間短、溶劑消耗及廢物產(chǎn)生量低、提取選擇性和提取物的純度高等特點(diǎn)而被廣泛用于天然植物的提取中[3-7]。實(shí)驗(yàn)過程中還比較了提取10 min、20 min、30 min對藥材提取率的影響 ,結(jié)果表明 20 min與 30 min提取率接近,因此,采用微波動態(tài)回流提取法提取 20 min對 7種龍膽花進(jìn)行提取制樣。

3.3 檢測波長的確定

將獐牙菜苦苷、龍膽苦苷對照品溶液在 200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果在 240 nm處有較好吸收,故選擇 240 nm為檢測波長。

3.4 流動相的選擇

在篩選獐牙菜苦苷與龍膽苦苷兩種活性成分測定的色譜條件過程中,曾嘗試過用不同比例的甲醇-0.2%的磷酸作為流動相進(jìn)行梯度洗脫,發(fā)現(xiàn)甲醇-0.2%磷酸溶液梯度洗脫 (0～25 min:15%～30%),流速:1 mL/min,7種龍膽花中獐牙菜苦苷和龍膽苦苷的色譜峰與共存組分完全達(dá)到基線分離。

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