任紅榮,姜洪芳,單承鶯,李 娜,張衛(wèi)明

(1.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210097;2.南京野生植物綜合利用研究院,江蘇南京 210042)

香水蓮花是睡蓮科 Nymphaea水生宿根草本植物,屬于大型睡蓮類,既是重要的園林觀賞花卉,又是生產(chǎn)切花的新興品種。香水蓮花的降血脂作用已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[1]。以香水蓮花焙制的茶風(fēng)味獨(dú)特。坊間以香水蓮花中的多糖膠敷面,據(jù)說有很好的嫩膚與美白作用。

近年來,微波因促進(jìn)反應(yīng)的高效性和強(qiáng)選擇性及操作簡便、副產(chǎn)物少、產(chǎn)率高及產(chǎn)物易提純等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于生化蛋白水解及有機(jī)物萃取、酯化等反應(yīng)中[2-3]。微波提取 (簡稱MAE)是通過微波處理和適當(dāng)操作進(jìn)行有機(jī)化合物萃取的新技術(shù)。本研究通過對微波提取香水蓮花黃酮的工藝條件的探討,對微波技術(shù)應(yīng)用到黃酮的提取方面具有一定的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

香水蓮花帶雄蕊的干燥花托:浙江省溫州市三心美德投資有限公司提供。七月采摘,剝?nèi)ポ嗥突ò?貼近花托基部切去花梗,鼓風(fēng)干燥。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:中國藥品生物制品檢定所,純度99.9%。

1.2 試劑

95%乙醇:工業(yè)酒精;石油醚:分析純,南京化學(xué)試劑有限公司

1.3 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;

電子天平 EL-410s 美國 Setra;

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE-52AA 上海亞榮生化儀器廠;

WLD07S-05型微波設(shè)備 南京三樂微波技術(shù)發(fā)展有限公司;

TU-1800紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;

離心沉淀機(jī)LXJ-Ⅱ(4000 r/min) 上海醫(yī)用分析儀器廠;

電熱鼓風(fēng)干燥箱 南京電器三廠。

2 方 法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置

精密稱取 120℃常壓干燥至恒重的蘆丁 10.3 mg,以 75%乙醇為溶劑,定容至 50 mL容量瓶中,配置成 0.206 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 樣品溶液的配置

稱取香水蓮花干粉 10 g,按 1∶10比例加入石油醚回流脫脂 2次,每次 2 h。脫脂后的香水蓮花粉烘干后備用。精密稱取 5 g脫脂的香水蓮花干粉,加入 20 mL 70%乙醇熱回流提取 2次,每次 2 h,過濾提取液,以適量 70%乙醇洗滌濾紙和濾渣,合并濾液及洗滌液并減壓濃縮至浸膏,抽真空干燥。精密稱取 0.02 g香水蓮花干燥物,以 75%的乙醇為溶劑,定容到 50 mL的容量瓶中,配置 0.4 mg/mL的樣品溶液。

2.3 測定波長的確定

采用三氯化鋁顯色法確定香水蓮花總黃酮測定的波長。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液 0.1 mL,以 75%的乙醇為溶劑,定容至 10 mL的容量瓶中,分別吸取 2 mL,加 2 mL 1%三氯化鋁顯色 10 min后在 200～600 nm波長范圍內(nèi)掃描,均以 1%三氯化鋁為空白對照。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法

精密稱取 120℃常壓干燥至恒重的蘆丁 20 mg,用 75%的乙醇定容至 100 mL作為母液。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別置于 25 mL容量瓶中,用 75%的乙醇定容。分別吸取 2 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液加 2 mL 1%三氯化鋁顯色 10 min后,以 1%三氯化鋁溶液作為空白對照,在波長 425 nm處測定吸光度值。以蘆丁量為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 因素試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)中,選取乙醇濃度、微波功率、提取時(shí)間 3個(gè)單因素,確定其影響大小,固液比在正交設(shè)計(jì)中考察其對香水蓮花黃酮含量的影響。

2.5.1 提取溶劑系統(tǒng)的選擇

將香水蓮花雄蕊粉碎至 40目,用石油醚熱回流脫脂兩次,每次 2.5 h,過濾,濾渣于 60℃烘箱烘干,密封待用。

準(zhǔn)確稱取 5.0 g 40目的脫脂香水蓮花干粉,用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 50%,60%,70%,80%的乙醇溶液浸泡2 h,于微波連續(xù)反應(yīng)器中回流提取,微波功率350 W,提取時(shí)間為 60 min。提取液真空抽濾,減壓濃縮成浸膏,真空干燥,稱重 M。取 0.02 g加 75%乙醇加熱溶解,于 25 mL容量瓶中定容,再以 1∶1的比例加入三氯化鋁顯色 10 min后,作為香水蓮花總黃酮樣品待測液,于 425 nm處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得樣品液黃酮量m。

計(jì)算:香水蓮花黃酮得率 =[M ×m/0.02×5]×100%。

2.5.2 提取時(shí)間對香水蓮花黃酮含量的影響

用 70%的乙醇溶液回流提取香水蓮花黃酮 20 min、40 min、60 min、80 min,其它條件同 2.5.1節(jié)。2.5.3 微波功率對香水蓮花黃酮含量的影響

在微波功率 150 W、200 W、250 W、300 W的條件下,用 70%的乙醇溶液回流提取香水蓮花黃酮,其它條件同 2.3.1節(jié)。

2.6 香水蓮花總黃酮提取工藝的優(yōu)化

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以香水蓮花總黃酮得率為指標(biāo),選用 L9(34)正交試驗(yàn),考察微波提取時(shí)間(A)、70%乙醇用量 (B)和微波功率 (C)對提取效果的影響,因素水平見表1。

表1 因素水平表L9(34)

3 結(jié)果與分析

3.1 測定波長的確定

經(jīng)波譜分析,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在 425 nm處有最大吸收,樣品在 425 nm處接近最大吸收。因此選擇425 nm作為黃酮含量的測定波長。

3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù) 2.4節(jié)中的方法繪制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。求得到回歸方程:y=0.025 1x+0.009 2;R2=0.999 2,表明蘆丁在本實(shí)驗(yàn)涉及的濃度范圍 4～40 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 單因素試驗(yàn)

3.3.1 乙醇濃度對香水蓮花黃酮得率的影響

圖2 乙醇濃度對香水蓮花黃酮得率的影響

試驗(yàn)采用不同濃度的乙醇溶液提取香水蓮花黃酮,旨在討論乙醇濃度對香水蓮花黃酮提取效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到 70%～80%時(shí),香水蓮花總黃酮含量處于平臺期。為了節(jié)省乙醇溶劑,故選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 70%的乙醇為最佳提取濃度。這可能與黃酮類化合物的極性有關(guān),因?yàn)槲⒉ㄌ崛〉倪x擇性主要取決于目標(biāo)物質(zhì)和溶劑性質(zhì)的相似性;另外,提高乙醇濃度可以增加提取溶劑對物料的滲透性,提高黃酮類的溶解度。但在使用微波加熱時(shí),主要是物料中的極性分子尤其是水分子吸收微波能,產(chǎn)生大量的熱量,使物料升溫,乙醇濃度的增加減小了料液中水的比例,會使料液升溫減慢,從而影響得率[4]。

3.3.2 微波時(shí)間、微波功率對香水蓮花黃酮得率的影響

微波輻射在短時(shí)間內(nèi)[5]對細(xì)胞膜的破碎作用比較大,溶出目的物多,所以得率上升較快;提取液中總黃酮含量隨功率增大而升高,這可能是由于功率增大,加熱速率就增大,因此分子運(yùn)動(dòng)速度加快,摩擦增加,物質(zhì)的滲透、擴(kuò)散和溶解速度加快,有利于有效物質(zhì)由外層細(xì)胞轉(zhuǎn)移到溶劑中。微波功率超過 250 W時(shí),黃酮得率增加緩慢,故選定微波功率為250 W。

微波提取時(shí)間超過 80 min后,提取液總黃酮含量下降可能是強(qiáng)熱效應(yīng)對其產(chǎn)生了破壞作用,溶解出的雜質(zhì)增多[6]。微波提取時(shí)間為 40 min與80 min時(shí),黃酮得率相差不大,為了節(jié)約時(shí)間,故選定微波時(shí)間為 40 min。

3.4 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn) -提取工藝條件選擇

以總黃酮得率為評價(jià)指標(biāo),由直觀分析看出,影響香水蓮花總黃酮提取效果的因素為 B>A>C,以料液比的影響最大;由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,各因素對香水蓮花黃酮得率的影響力大小依次為乙醇用量、微波提取時(shí)間、微波功率。其中微波功率和微波提取時(shí)間對微波連續(xù)反應(yīng)提取香水蓮花黃酮的效果影響不顯著,乙醇用量影響顯著,確定最佳提取工藝為A1B3C2,即乙醇溶液為 70%,液料比 25∶1,微波功率250 W,提取時(shí)間 40 min。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按正交試驗(yàn)選取的最佳提取工藝條件 A1、B3、C2進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn),所得結(jié)果重現(xiàn)性較好,黃酮得率較高,結(jié)果較為理想。結(jié)果見表3。

表3 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié) 論

本文采用改進(jìn)的家用微波爐,用微波蒸餾法連續(xù)提取香水蓮花總黃酮,該工藝簡單可行,省時(shí)經(jīng)濟(jì)。此方法也適用于后續(xù)分離純化工序中的含量測定。本研究微波連續(xù)提取香水蓮花黃酮的最佳工藝條件為:乙醇濃度為 70%,微波功率 250 W、微波提取時(shí)間 40 min、液料比為 25∶1,最高總黃酮得率為2.166%,為香水蓮花黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

[1] 張衛(wèi)明,姜洪芳,徐 輝,等.香水蓮花降血脂作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].食品工業(yè)科技,2009,30(2):111-112.

[2] 陳 猛,袁東星.微波法萃取辣椒中辣椒素的研究[J].食品科學(xué),1999,10:25-27.

[3] 楊海燕.微波輻照誘導(dǎo)萃取纈草天然香料的研究[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,21(2):85-88.

[4] 王 軍,王 敏,李小艷.微波提取苦蕎麥麩皮總黃酮工藝研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2006,18:655.

[5] 龔盛昭,楊卓如,曾海宇.微波提取黃芪甲苷的工藝研究[J].中成藥,2005,27(8):889.

[6] 李怡彬,鄭明初,鄭寶東.竹葉黃酮微波提取工藝的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊,2006(1):48.