白雪梅,趙愛蘭,張少敏,王憶婷,孫 暉,葉長蕓

豬鏈球菌四環(huán)素耐藥性與Tn916接合型轉(zhuǎn)座子的關(guān)系＊

白雪梅,趙愛蘭,張少敏,王憶婷,孫 暉,葉長蕓

目的 研究我國分離的血清2型豬鏈球菌四環(huán)素耐藥性與 Tn916接合型轉(zhuǎn)座子的關(guān)系。方法采用微量稀釋法進行藥物敏感性檢測,PCR方法檢測四環(huán)素耐藥基因及Tn916接合型轉(zhuǎn)座子。結(jié)果我們檢測了56株我國分離的血清2型豬鏈球菌及12株國外分離的血清2型豬鏈球菌,56株我國分離株均對四環(huán)素耐藥并且攜帶四環(huán)素耐藥基因tet(M),我國豬鏈球菌攜帶的tet(M)基因位于接合型轉(zhuǎn)座子 Tn916上。12株國外分離株有7株對四環(huán)素耐藥,這7株菌攜帶四環(huán)素耐藥基因tet(O)并且 Tn916檢測為陰性。結(jié)論Tn916上的tet(M)基因編碼了我國血清2型豬鏈球菌的四環(huán)素耐藥性,我國血清2型豬鏈球菌可能在進化過程中通過水平轉(zhuǎn)移的方式獲得了Tn916接合型轉(zhuǎn)座子。

豬鏈球菌;tet(M)耐藥基因;接合型轉(zhuǎn)座子

豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病原菌,2005年我國四川省暴發(fā)了豬鏈球菌引起人類感染的疫情,204人感染,38人死亡。在世界范圍內(nèi),截至2007年共有409人感染豬鏈球菌的報道,共73人死亡〔1〕。這一人獸共患病原菌越來越受到關(guān)注。我們以前的實驗發(fā)現(xiàn)我國分離株具有比較普遍的四環(huán)素耐藥性。有研究表明,轉(zhuǎn)座子Tn916介導(dǎo)了四環(huán)素耐藥基因的轉(zhuǎn)移。為此,我們通過進一步的檢測探討了豬鏈球菌四環(huán)素耐藥性與轉(zhuǎn)座子的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 我國分離的56株豬鏈球菌包括:1998年江蘇病人來源菌株3株,豬來源菌株2株,2005年四川病人來源菌株30株,四川豬來源菌株5株,廣東病人來源菌株1株,廣西病人來源菌株1株,貴州病人來源菌株1株,江西病人來源菌株1株,江西豬來源菌株1株。2006年四川健康豬來源菌株5株,2007年四川健康豬來源菌株5株。2009年病人來源菌株1株。12株國外來源菌株為加拿大Gao ttschalk教授惠贈。

1.2 藥敏實驗方法 采用DADE BEHRING公司生產(chǎn)的1型 M ICroSTREP PLusTM鏈球菌藥物敏感性檢測板。同時接種質(zhì)控菌株A TCC49619進行實驗條件的質(zhì)量控制。

1.3 耐藥基因檢測 目前發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素耐藥基因已達30多種,我們檢測了革蘭氏陽性菌常見的5種四環(huán)素耐藥基因 tet(K)、tet(L)、tet(M)、tet(O)和tet(Q)〔2〕。

1.4 接合型轉(zhuǎn)座子 Tn916的檢測 Tn916是于1981年在糞腸球菌中發(fā)現(xiàn)的第1個接合型轉(zhuǎn)座子。糞腸球菌DS16菌株的 Tn916(NC_006372)長度為18kb,攜帶有四環(huán)素耐藥基因tet(M),共24個ORF(見圖1和表1)。使用PCR方法,在實驗菌株中對Tn916轉(zhuǎn)座子編碼的24個ORF進行了檢測。

圖1 轉(zhuǎn)座子Tn916結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Genetic organization of transposon Tn916

表1 轉(zhuǎn)座子Tn916的檢測引物Table 1 Primers for detection of transposon Tn916

1.5 DNA測序 PCR產(chǎn)物純化后進行直接測序,由TA KARA公司完成。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏結(jié)果 我國分離的56株豬鏈球菌對青霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、美羅培南、左旋氟沙星、氯霉素、紅霉素、阿齊霉素、克林霉素、萬古霉素均敏感,對四環(huán)素均耐藥。加拿大惠贈的12株血清2型豬鏈球菌中,有7株菌對四環(huán)素耐藥。

2.2 四環(huán)素耐藥基因檢測結(jié)果 使用PCR方法檢測了四環(huán)素相關(guān)的耐藥基因5種,發(fā)現(xiàn)我國分離的56株菌均攜帶tet(M)基因。加拿大惠贈的12株血清2型豬鏈球菌中,有7株菌對四環(huán)素耐藥,這7株菌則攜帶四環(huán)素耐藥基因tet(O)。

2.3 Tn916的檢測結(jié)果 Int-Tn是轉(zhuǎn)座子 Tn916的整合酶基因,編碼轉(zhuǎn)座子整合到新位點所需的整合酶,測定 Int-Tn是目前檢測 Tn916常見的方法〔3〕。以 Int-Tn為代表基因檢測了我國分離的56株豬鏈球菌,結(jié)果均為陽性。檢測的12株加拿大惠贈菌株,結(jié)果均為陰性。為進一步確定我國菌株攜帶Tn916的完整性,使用PCR方法檢測了 Tn916轉(zhuǎn)座子編碼的24個ORF,發(fā)現(xiàn)我國分離的56株菌均攜帶完整的Tn916轉(zhuǎn)座子。

圖2 Tn916轉(zhuǎn)座子基因的檢測結(jié)果Fig.2 The PCR production of Tn916 1:ORF24;2:ORF23;3:ORF22;4:ORF21;5:ORF20;6:ORF19;7:ORF18;8:ORF17;9:ORF16;10:ORF15;11:ORF14;12:ORF(13,12);13:tet(M);14:ORF(5,6,7,8,9,10);15:Xis-Tn;16:Int-Tn.

2.4 測序結(jié)果 以我國豬鏈球菌分離株SC84為代表,將 PCR產(chǎn)物測序后,得到了 SC84所攜帶轉(zhuǎn)座子的全序列。GenBank注冊號為 EF432727。將SC84菌株攜帶的 Tn916和已經(jīng)發(fā)表的糞腸球菌DS16攜帶的 Tn916序列進行比較,發(fā)現(xiàn)二者的同源性高達99.3%。在133個差異核苷酸中,有91個位于tet(M),他們的tet(M)序列的同源性為95%。除tet(M)外,其它區(qū)段只有42個堿基不同。

3 討 論

tet(M)是傳播最為廣泛的四環(huán)素耐藥基因,已從臨床分離的8種革蘭氏陰性菌,18種革蘭氏陽性菌中檢出tet(M)基因〔4〕。加拿大惠贈的12株血清2型豬鏈球菌,有7株對四環(huán)素耐藥,編碼基因為tet(O)。tet(M)和 tet(O)均編碼核糖體保護蛋白,同源性可以達到75%,但tet(M)一般攜帶于接合型轉(zhuǎn)座子,而 tet(O)一般定位于染色體或質(zhì)?！?〕。tet(O)的傳播沒有tet(M)那樣廣泛。

tet(M)位于 Tn916家族接合型轉(zhuǎn)座子上。接合型轉(zhuǎn)座子能通過細胞間的接觸從供體菌基因組轉(zhuǎn)移到受體菌基因組。它兼具有轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和噬菌體的一些特征〔6〕。Tn916是于1981年在糞腸球菌中發(fā)現(xiàn)的。后來又從其它細菌中發(fā)現(xiàn)許多接合型轉(zhuǎn)座子 ,如 Tn916S、Tn5386、Tn6009 等〔7-9〕。糞腸球菌DS16菌株的 Tn916(NC_006372)長度為18kb,包括 tet(M)基因在內(nèi),共 24個 ORF,ORF23～ORF13為接合性轉(zhuǎn)移基因,位于右末端。除ORF9外,所有基因方向為從右到左。Tn916整合酶基因(int)編碼重組酶,附近的切除酶基因(xis)編碼類似于lambda Xis的小基礎(chǔ)蛋白,目前尚有部分基因功能不明〔10〕。

我們在豬鏈球菌中檢測到了攜帶 tet(M)等位基因的 Tn916接合型轉(zhuǎn)座子。與糞腸球菌DS16的Tn916(NC_006372)進行全序列比較發(fā)現(xiàn),同源性達到99.3%。共有133個核苷酸的差異點,其中91個位于 tet(M),他們的 tet(M)序列的同源性為95%。除tet(M)外的其它42個差異核苷酸,分布在15個基因上。每個基因分別有1～4個差異核苷酸。在加拿大惠贈菌株中則沒有檢測出 Tn916的存在。Tn916家族接合型轉(zhuǎn)座子宿主譜廣泛,能在多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌間轉(zhuǎn)移,其中常見的是腸道正常菌群和條件致病菌即糞腸球菌。這提示我國分離豬鏈球菌攜帶的 tet(M)基因可能是由糞腸球菌水平轉(zhuǎn)移獲得的。另外,在我國分離的豬鏈球菌中檢測到了 Tn916轉(zhuǎn)座子的存在,這可能和四環(huán)素在養(yǎng)豬行業(yè)飼料添加劑中的廣泛使用有關(guān)。

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Relationship between tetracycline resistance of Streptococcus suis and Tn916-like con jugative transposon

BA IXue-mei,ZHAO Ai-lan,ZHANG Shao-min,WANG Yi-ting,SUN Hui,YE Chang-yun
(State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control,National Institute for Communicable Diseases Control and Prevention,Chinese Center for Diseases Control and Prevention,Beijing 102206,China)

To study the relationship between tetracycline resistance of Streptococcussuis serotype 2 isolated in China and Tn916-like conjugative trans poson,microdilution method was employed for the analysis of antimicrobial sensitivity,and PCR detection of tetracycline resistance genes and Tn916 conjugative transposon was conducted.Tetracycline resistant gene detection was performed for the 56 serotype-2 strains of Streptococcus suis isolated in China and 12 from other countries.It was found that all 56 strains isolated in China was resistant to tetracycline and carried tet(M)gene,and those tet(M)genes carried by China’s Strep to coccus suis were all located on the conjugative transposon Tn916.While the 12 strains from other countries carried tet(O)gene instead of tet(O)gene.It is suggested that S.suisserotype 2 strain might have

the transposon Tn916 conjugative transposon by horizontal transferring during its evolution.

Streptococcus suis;tet(M)resistance gene;conjugative transposon

R378.1

A

1002-2694(2010)12-1085-03

＊科技部國際科技合作與交流專項(20072930)資助

葉長蕓,Email:yechangyun@icdc.cn

中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所,傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室,北京 102206

2010-09-15;

2010-10-15