毛玲玲,姚文清,耿英芝,秦彩明,李 鑫,孫廣玖,劉權(quán)恕,張 旭,李松巖,陳靜乙

2.營口市疾病預防控制中心,營口 115004;

3.錦州市疾病預防控制中心,錦州 121004;

4.鐵嶺市地方病防治所,鐵嶺 112000;

5.中國醫(yī)科大學,沈陽 110001

布魯氏菌病(Brucellosis),簡稱布病,是由布魯氏菌屬(Brucella)的細菌侵入機體所引發(fā)的傳染-變態(tài)反應性人獸共患傳染病。布魯氏菌侵入機體后可引起神經(jīng)、生殖、循環(huán)、免疫等系統(tǒng)的損傷,常伴隨菌血癥,毒血癥,嚴重時可造成傷殘甚至死亡〔1〕。近十幾年,我國人間布魯氏菌病疫情持續(xù)上升。遼寧省的布病疫情居于全國前列,也呈上升趨勢,對人民生命財產(chǎn)安全造成了巨大的威脅。歷史上遼寧省曾有牛種布病流行。為了解疫情和查明菌型特征,我們對臨床發(fā)熱病人進行了血清抗體檢測及病原分離培養(yǎng),對分離到的布魯氏菌株進行噬菌體裂解及分子生物學等分型研究。

1 材料與方法

1.1 人間疫情調(diào)查 發(fā)病資料從流行病學個案調(diào)查表和傳染病網(wǎng)絡直報系統(tǒng)獲得。

1.2 發(fā)熱病人中布魯氏菌感染率調(diào)查 收集定點醫(yī)院發(fā)熱患者血清,進行SAT試驗檢測。SAT試驗操作按文獻〔2〕73-75進行 。

1.3 病原分離鑒定 床邊無菌操作,接種需氧血培養(yǎng)瓶,放入自動血培養(yǎng)儀,待指示有菌生長,轉(zhuǎn)種血平皿或布氏瓊脂斜面分純、保存、鑒定。

1.4 生物噬菌體分型 醋酸鉛紙條、三勝黃素溶液由本室自制,參考菌株、試管凝集試劑及對照、Wb、Bk2、Tb噬菌體 、布病陽性血清、A 、M 分型血清、硫堇紙片、堿性復紅紙片均由國家CDC傳染病所提供,有效期內(nèi)使用。噬菌體裂解實驗按文獻〔2〕19-27進行。

1.5 分子生物學分型鑒定 細菌DNA提取按照Qiangen核酸提取試劑盒說明書進行。BCSP31-PCR引物及擴增體系均參考文獻〔3〕進行;AMOSPCR引物及擴增體系均參考文獻〔4〕進行;多重PCR根據(jù)布魯氏菌6個種的差異基因設計5對引物,用混合體系PCR對布魯氏菌進行鑒定。引物及擴增體系均參考文獻〔5-6〕進行。

2 結(jié) 果

2.1 人間疫情情況 歷史上遼寧省布病疫情持續(xù)存在,但處于低流行態(tài)勢,發(fā)病率在0.025/10萬左右;但到1994年后疫情明顯回升,1994-2002年發(fā)病率波動在0.16/10萬～0.67/10萬之間,2003年開始疫情明顯上升,2004年發(fā)病率達2.50/10萬,近幾年發(fā)病率在0.80/10萬～1.43/10萬,居于全國前列。

圖1 1999-2009年遼寧省布病發(fā)病數(shù)、發(fā)病率Fig.1 Brucellosis incidence and morbidity in 1999-2009 of Liaoning province

2.1.1 時間分布 遼寧省人間布病發(fā)病時間主要集中在3～7月,與從事畜牧業(yè)生產(chǎn)季節(jié)相關(guān)。

2.1.2 地區(qū)分布 歷史上遼寧省北部的鐵嶺、撫順為布病高發(fā)地區(qū)。但近5年來,遼西、遼南的發(fā)病上升顯著。2004-2008年間,我省布病發(fā)病率居于前3位的地區(qū)分別為錦州、葫蘆島、營口。錦州市發(fā)病率為3.60/10萬～8.2/10萬之間,明顯高于全省。

2.1.3 人群分布 性別主要以男性為主。20～50歲的青壯勞動力為主。如2004年男性病例813例,占78.25%,20～50歲 804例,占 74.75%。主要集中在農(nóng)民、牧民等職業(yè)上。2004-2008年農(nóng)民病例占77.38%,以上人群從事飼養(yǎng)羊群,接觸感染機會較多。

2.2 發(fā)熱病人中布魯氏菌感染率調(diào)查 2004-2008年檢測發(fā)熱患者血清1 093例,采用RBPT初篩、SAT檢測確定,布病抗體陽性患者 216名,平均陽性率為 21.59%。其中2004年陽性率最高,為33.33%,2007年陽性率最低,為 16.67%,詳見表1。

表1 2004-2008年發(fā)熱病人血清SAT檢測結(jié)果Table 1 SAT serum antibody result of the patients with fever in 2004-2008

2.3 病原分型鑒定

2.3.1 菌株常規(guī)鑒定及生物分型結(jié)果 2004-2008年間,從患者血液(31份)、骨髓(1份)標本中共分離到32株布魯氏菌,其中20株布魯氏菌分離于營口地區(qū),7株布魯氏菌分離于錦州地區(qū),鐵嶺、鞍山地區(qū)各分離到2株布魯氏菌,撫順地區(qū)分離到1株布魯氏菌。對以上菌株進行常規(guī)鑒定、噬菌體裂解分型。29株菌被鑒定為羊種3型布魯氏菌,其余3株為BK噬菌體裂解,Tb、Wb噬菌體不裂解,陽性血清凝集,而A、M 因子血清未見清晰凝集,較羊種菌有較多H2S產(chǎn)生,定為變異布氏菌株。

2.3.2 BCSP31-PCR結(jié)果 32株布魯氏菌在223 bp處均出現(xiàn)特異性擴增條帶,從分子水平證明這32株菌均屬于布魯氏菌屬,見圖2。

圖2 部分菌株BCSP31-PCR擴增結(jié)果M：DL2000 DNA Ladder;1～5：待測分離株;-：陰性對照,+：羊種布氏菌對照Fig.2 The BCSP31-PCR amplification results of a part of strains

2.3.3 AMOS-PCR分型結(jié)果 通過AMOS-PCR分型檢測,32株布魯氏菌在731 bp處出現(xiàn)條帶,從而證明這32株菌均為羊種布魯氏菌,見圖3。

2.3.4 多重PCR分型鑒定結(jié)果 通過多重PCR分型檢測,32株布魯氏菌在1 682 bp、1 071 bp、794 bp、152 bp處出現(xiàn)條帶,而272 bp處特異性條帶缺如。從而證明這 32株菌均為羊種布魯氏菌,見圖4。

3 討 論

通過對遼寧省2004-2008年布病疫情的分析,發(fā)現(xiàn)了疫情的嚴重性。定點醫(yī)院發(fā)熱病人進行布病血清抗體檢測,布病發(fā)病 219人,陽性率為21.59%,可見我省布病疫情的嚴重程度。遼寧省相鄰各省都是布魯氏菌病高發(fā)區(qū),全省農(nóng)村是農(nóng)牧混雜地區(qū),青壯年農(nóng)民進行畜牧養(yǎng)殖較多,與牲畜接觸的機會多,布病發(fā)病的季節(jié)性規(guī)律為2～3月份屠宰、接產(chǎn)高峰感染,3～4月份發(fā)病,5～6月份就診,得到疫情報告。農(nóng)村牲畜買賣頻繁,檢疫、免疫無保障。群眾缺乏布病防治知識,造成布病近年高發(fā)疫情,而且青壯年是主要疫情防治對象。

對32株布氏菌分型看出遼寧省的優(yōu)勢流行菌型為羊3型。通過對193例病例的流行病學個案調(diào)查,結(jié)果表明感染病例主要為接觸病羊感染,占89.12%?？梢娺|寧省布魯氏菌病傳染源主要是患病的羊,建議羊布病為傳染源防病重點。

國際公認的布魯氏菌鑒定方法對流行病學分析和布病的防治有很大意義。但是非典型菌株多有出現(xiàn)。本研究中就有3株變異菌株。用分子生物學分型方法對這些非典型菌株進行鑒定已成為新的發(fā)展方向。本次研究運用 BCSP31-PCR、AMOS-PCR以及多重PCR 3種方法,同時對32株布魯氏菌進行了實驗,均鑒定為羊種布魯氏菌?？朔司曜儺愐蛩?可以作為傳統(tǒng)分類方法的補充。對于3株變異菌株,在多重PCR擴增結(jié)果中可以看到,其條帶與其他菌株的條帶略有不同,說明這3株菌在基因水平上發(fā)生了變異,提示是進一步研究的方向。

〔1〕王季秋.布氏菌病各系統(tǒng)損傷的研究進展〔J〕.中國地方病防治雜志,2002,17(5)：277-280.

〔2〕肖東樓.布魯氏菌病防治手冊〔M〕.1版.人民衛(wèi)生出版社,2008：73-75,19-27.

〔3〕鄧小玲,陳經(jīng)雕,柯碧霞,等.廣東省布魯氏菌分離株的分子特征分析〔J〕.中國人獸共患病學報,2008,24(9)：851-854.

〔4〕姜海,崔步云,趙鴻雁等.AMOS-PCR對布魯氏菌種型鑒定的應用〔J〕.中國人獸共患病學報,2009,25(2)：107-109.

〔5〕Garcia-Yoldi D,Marin C M,de Miguel M J.et al.Multiplex PCR assay for the identification and differentiation of all brucella species and the vaccine strainsBrucella abortusS19 and RB51 andBrucella melitensisRev1〔J〕.Clinical Chemistry,2006,52(4)：779-781.

〔6〕劉國棟,劉國棟,劉榮臻,等.布魯氏菌多重聚合酶鏈反應鑒定研究〔J〕.疾病監(jiān)測,2008,23(5)：271-273.