毛玲玲,姚文清,耿英芝,秦彩明,李 鑫,孫廣玖,劉權(quán)恕,張 旭,李松巖,陳靜乙

2.營口市疾病預(yù)防控制中心,營口 115004;

3.錦州市疾病預(yù)防控制中心,錦州 121004;

4.鐵嶺市地方病防治所,鐵嶺 112000;

5.中國醫(yī)科大學(xué),沈陽 110001

布魯氏菌病(Brucellosis),簡稱布病,是由布魯氏菌屬(Brucella)的細(xì)菌侵入機(jī)體所引發(fā)的傳染-變態(tài)反應(yīng)性人獸共患傳染病。布魯氏菌侵入機(jī)體后可引起神經(jīng)、生殖、循環(huán)、免疫等系統(tǒng)的損傷,常伴隨菌血癥,毒血癥,嚴(yán)重時可造成傷殘甚至死亡〔1〕。近十幾年,我國人間布魯氏菌病疫情持續(xù)上升。遼寧省的布病疫情居于全國前列,也呈上升趨勢,對人民生命財產(chǎn)安全造成了巨大的威脅。歷史上遼寧省曾有牛種布病流行。為了解疫情和查明菌型特征,我們對臨床發(fā)熱病人進(jìn)行了血清抗體檢測及病原分離培養(yǎng),對分離到的布魯氏菌株進(jìn)行噬菌體裂解及分子生物學(xué)等分型研究。

1 材料與方法

1.1 人間疫情調(diào)查 發(fā)病資料從流行病學(xué)個案調(diào)查表和傳染病網(wǎng)絡(luò)直報系統(tǒng)獲得。

1.2 發(fā)熱病人中布魯氏菌感染率調(diào)查 收集定點醫(yī)院發(fā)熱患者血清,進(jìn)行SAT試驗檢測。SAT試驗操作按文獻(xiàn)〔2〕73-75進(jìn)行 。

1.3 病原分離鑒定 床邊無菌操作,接種需氧血培養(yǎng)瓶,放入自動血培養(yǎng)儀,待指示有菌生長,轉(zhuǎn)種血平皿或布氏瓊脂斜面分純、保存、鑒定。

1.4 生物噬菌體分型 醋酸鉛紙條、三勝黃素溶液由本室自制,參考菌株、試管凝集試劑及對照、Wb、Bk2、Tb噬菌體 、布病陽性血清、A 、M 分型血清、硫堇紙片、堿性復(fù)紅紙片均由國家CDC傳染病所提供,有效期內(nèi)使用。噬菌體裂解實驗按文獻(xiàn)〔2〕19-27進(jìn)行。

1.5 分子生物學(xué)分型鑒定 細(xì)菌DNA提取按照Qiangen核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行。BCSP31-PCR引物及擴(kuò)增體系均參考文獻(xiàn)〔3〕進(jìn)行;AMOSPCR引物及擴(kuò)增體系均參考文獻(xiàn)〔4〕進(jìn)行;多重PCR根據(jù)布魯氏菌6個種的差異基因設(shè)計5對引物,用混合體系PCR對布魯氏菌進(jìn)行鑒定。引物及擴(kuò)增體系均參考文獻(xiàn)〔5-6〕進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 人間疫情情況 歷史上遼寧省布病疫情持續(xù)存在,但處于低流行態(tài)勢,發(fā)病率在0.025/10萬左右;但到1994年后疫情明顯回升,1994-2002年發(fā)病率波動在0.16/10萬～0.67/10萬之間,2003年開始疫情明顯上升,2004年發(fā)病率達(dá)2.50/10萬,近幾年發(fā)病率在0.80/10萬～1.43/10萬,居于全國前列。

圖1 1999-2009年遼寧省布病發(fā)病數(shù)、發(fā)病率Fig.1 Brucellosis incidence and morbidity in 1999-2009 of Liaoning province

2.1.1 時間分布 遼寧省人間布病發(fā)病時間主要集中在3～7月,與從事畜牧業(yè)生產(chǎn)季節(jié)相關(guān)。

2.1.2 地區(qū)分布 歷史上遼寧省北部的鐵嶺、撫順為布病高發(fā)地區(qū)。但近5年來,遼西、遼南的發(fā)病上升顯著。2004-2008年間,我省布病發(fā)病率居于前3位的地區(qū)分別為錦州、葫蘆島、營口。錦州市發(fā)病率為3.60/10萬～8.2/10萬之間,明顯高于全省。

2.1.3 人群分布 性別主要以男性為主。20～50歲的青壯勞動力為主。如2004年男性病例813例,占78.25%,20～50歲 804例,占 74.75%。主要集中在農(nóng)民、牧民等職業(yè)上。2004-2008年農(nóng)民病例占77.38%,以上人群從事飼養(yǎng)羊群,接觸感染機(jī)會較多。

2.2 發(fā)熱病人中布魯氏菌感染率調(diào)查 2004-2008年檢測發(fā)熱患者血清1 093例,采用RBPT初篩、SAT檢測確定,布病抗體陽性患者 216名,平均陽性率為 21.59%。其中2004年陽性率最高,為33.33%,2007年陽性率最低,為 16.67%,詳見表1。

表1 2004-2008年發(fā)熱病人血清SAT檢測結(jié)果Table 1 SAT serum antibody result of the patients with fever in 2004-2008

2.3 病原分型鑒定

2.3.1 菌株常規(guī)鑒定及生物分型結(jié)果 2004-2008年間,從患者血液(31份)、骨髓(1份)標(biāo)本中共分離到32株布魯氏菌,其中20株布魯氏菌分離于營口地區(qū),7株布魯氏菌分離于錦州地區(qū),鐵嶺、鞍山地區(qū)各分離到2株布魯氏菌,撫順地區(qū)分離到1株布魯氏菌。對以上菌株進(jìn)行常規(guī)鑒定、噬菌體裂解分型。29株菌被鑒定為羊種3型布魯氏菌,其余3株為BK噬菌體裂解,Tb、Wb噬菌體不裂解,陽性血清凝集,而A、M 因子血清未見清晰凝集,較羊種菌有較多H2S產(chǎn)生,定為變異布氏菌株。

2.3.2 BCSP31-PCR結(jié)果 32株布魯氏菌在223 bp處均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶,從分子水平證明這32株菌均屬于布魯氏菌屬,見圖2。

圖2 部分菌株BCSP31-PCR擴(kuò)增結(jié)果M：DL2000 DNA Ladder;1～5：待測分離株;-：陰性對照,+：羊種布氏菌對照Fig.2 The BCSP31-PCR amplification results of a part of strains

2.3.3 AMOS-PCR分型結(jié)果 通過AMOS-PCR分型檢測,32株布魯氏菌在731 bp處出現(xiàn)條帶,從而證明這32株菌均為羊種布魯氏菌,見圖3。

2.3.4 多重PCR分型鑒定結(jié)果 通過多重PCR分型檢測,32株布魯氏菌在1 682 bp、1 071 bp、794 bp、152 bp處出現(xiàn)條帶,而272 bp處特異性條帶缺如。從而證明這 32株菌均為羊種布魯氏菌,見圖4。

3 討 論

通過對遼寧省2004-2008年布病疫情的分析,發(fā)現(xiàn)了疫情的嚴(yán)重性。定點醫(yī)院發(fā)熱病人進(jìn)行布病血清抗體檢測,布病發(fā)病 219人,陽性率為21.59%,可見我省布病疫情的嚴(yán)重程度。遼寧省相鄰各省都是布魯氏菌病高發(fā)區(qū),全省農(nóng)村是農(nóng)牧混雜地區(qū),青壯年農(nóng)民進(jìn)行畜牧養(yǎng)殖較多,與牲畜接觸的機(jī)會多,布病發(fā)病的季節(jié)性規(guī)律為2～3月份屠宰、接產(chǎn)高峰感染,3～4月份發(fā)病,5～6月份就診,得到疫情報告。農(nóng)村牲畜買賣頻繁,檢疫、免疫無保障。群眾缺乏布病防治知識,造成布病近年高發(fā)疫情,而且青壯年是主要疫情防治對象。

對32株布氏菌分型看出遼寧省的優(yōu)勢流行菌型為羊3型。通過對193例病例的流行病學(xué)個案調(diào)查,結(jié)果表明感染病例主要為接觸病羊感染,占89.12%。可見遼寧省布魯氏菌病傳染源主要是患病的羊,建議羊布病為傳染源防病重點。

國際公認(rèn)的布魯氏菌鑒定方法對流行病學(xué)分析和布病的防治有很大意義。但是非典型菌株多有出現(xiàn)。本研究中就有3株變異菌株。用分子生物學(xué)分型方法對這些非典型菌株進(jìn)行鑒定已成為新的發(fā)展方向。本次研究運(yùn)用 BCSP31-PCR、AMOS-PCR以及多重PCR 3種方法,同時對32株布魯氏菌進(jìn)行了實驗,均鑒定為羊種布魯氏菌。克服了菌株變異因素,可以作為傳統(tǒng)分類方法的補(bǔ)充。對于3株變異菌株,在多重PCR擴(kuò)增結(jié)果中可以看到,其條帶與其他菌株的條帶略有不同,說明這3株菌在基因水平上發(fā)生了變異,提示是進(jìn)一步研究的方向。

〔1〕王季秋.布氏菌病各系統(tǒng)損傷的研究進(jìn)展〔J〕.中國地方病防治雜志,2002,17(5)：277-280.

〔2〕肖東樓.布魯氏菌病防治手冊〔M〕.1版.人民衛(wèi)生出版社,2008：73-75,19-27.

〔3〕鄧小玲,陳經(jīng)雕,柯碧霞,等.廣東省布魯氏菌分離株的分子特征分析〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報,2008,24(9)：851-854.

〔4〕姜海,崔步云,趙鴻雁等.AMOS-PCR對布魯氏菌種型鑒定的應(yīng)用〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報,2009,25(2)：107-109.

〔5〕Garcia-Yoldi D,Marin C M,de Miguel M J.et al.Multiplex PCR assay for the identification and differentiation of all brucella species and the vaccine strainsBrucella abortusS19 and RB51 andBrucella melitensisRev1〔J〕.Clinical Chemistry,2006,52(4)：779-781.

〔6〕劉國棟,劉國棟,劉榮臻,等.布魯氏菌多重聚合酶鏈反應(yīng)鑒定研究〔J〕.疾病監(jiān)測,2008,23(5)：271-273.