徐臣光 (浙江省泰順縣人民醫(yī)院 325500)

PTEN(第10號染色體丟失的與張力蛋白同源的磷酸酶基因)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，在維持細胞的增殖、分化和凋亡中起重要作用，因其獨特的作用途徑和在多種人類腫瘤的發(fā)病機制中的重要作用而備受重視[1]。研究表明，PTEN是繼p53基因之后發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤中最易發(fā)生突變的抑癌基因[2]。人類許多腫瘤中存在著PTEN功能的失活。本研究通過免疫組化法檢測PTEN蛋白在大腸癌組織中的表達，并探討其與患者的臨床病理特征的關(guān)系?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 60例標(biāo)本均選自我院病理科存檔蠟塊，為2005年1月至2008年2月間收集的原發(fā)性結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本。所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛溶液固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明后，石蠟包埋，切片厚4μm。男37例，女23例；年齡37～75歲，平均54.2歲。所有標(biāo)本的患者術(shù)前均未接受化療及放療，另外取36例癌旁正常組織(距腫瘤邊緣5cm以上)作對照。

1.2 主要試劑和儀器 鼠抗人PTEN單克隆抗體(一抗，即用型)和免疫組化Envision試劑盒，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；YWY 781醫(yī)用微波儀，浙江臨安電子器材廠；LEICA顯微鏡DMLB，德國徠卡公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，嘉興新塍東城儀器廠；組織陳列儀為朝陽恒泰科技發(fā)展公司的產(chǎn)品(HT-1型)。

1.3 免疫組化染色 采用Envision二步法。切片常規(guī)脫蠟，3%過氧化氫溶液室溫孵育20min，水洗，0.05%胰酶37℃消化15min，PBS液沖洗，正常血清阻斷10min，分別滴加一抗工作液，PBS液沖洗，滴加二抗工作液37℃孵育30min，PBS液沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明和封片。以正常扁桃體組織做陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 免疫組化結(jié)果以胞漿或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。細胞未著色及陽性細胞<5%為陰性(－)；5%～25%的細胞顯色為弱陽性(＋)；25%～50%的細胞顯色為中等陽性(＋＋)；>50%的細胞顯色為強陽性(＋＋＋)。

2 結(jié)果

2.1 PTEN在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的表達 PTEN主要在結(jié)直腸癌胞漿表達，部分病例也可見到胞漿和胞膜同時著色，且染色較強。60例結(jié)直腸癌標(biāo)本中PTEN的陽性表達為18例(30.0%)，其中強陽性為6例(10.0%)，部分標(biāo)本表達降低或缺失。36例癌旁正常組織中PTEN蛋白表達均為陽性，其中強陽性31例(86.1%)。

2.2 結(jié)直腸癌中PTEN的表達與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)直腸癌高、中、低分化PTEN表達陽性情況依次為12例(50.0%,12/24)、5例(25.0%，5/20)和1例(1/16)，低分化、中分化結(jié)直腸癌陽性率較高分化明顯降低(χ2=9.107,P<0.01)，且PTEN表達水平隨原發(fā)病灶的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移呈逐漸下降趨勢。見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織中PTEN的表達與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

大腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多階段、有序的過程，主要是由于癌基因功能增強、抑癌基因及DNA修復(fù)基因突變或功能缺失所致。其中，癌基因的激活和抑癌基因的失活導(dǎo)致的細胞異常增殖是該過程中的重要分子機制之一[3]。

PTEN是近年發(fā)現(xiàn)的一個新的抑癌基因。PTEN基因定位于染色體10q23.3，全長218 kb，有9個外顯子和8個內(nèi)含子，長1212 bp，mRNA長5.5 kb，其cDNA含有一個1209 bp的開放閱讀框架，編碼由403個氨基酸殘基組成。PTEN中與抑癌功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)域主要是氨基端的磷酸酶結(jié)構(gòu)域、脂質(zhì)結(jié)合C2結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域。PTEN蛋白的氨基端與張力蛋白和輔助蛋白高度同源，與肌動蛋白在錨著點處結(jié)合，與該位點的復(fù)合物共同參與細胞生長調(diào)節(jié)，故PTEN可能通過下調(diào)該位點復(fù)合物中的整合素來抑制腫瘤。此外，PTEN還可通過參與細胞的聚集黏附而抑制腫瘤細胞的浸潤及轉(zhuǎn)移。目前已經(jīng)證實PTEN與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。在許多腫瘤中都有FIEN基因表達異常，且其表達異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)行為有一定相關(guān)性。

柯細松等[4]應(yīng)用PCR-LIS-SSCP 法對大腸癌及正常大腸石蠟包埋組織中PTEN的第7、8個外顯子進行點突變檢測，結(jié)果10例正常大腸組織未見陽性帶，60例大腸癌標(biāo)本中，第7外顯子SCPP帶型陽性檢出率為46.7%，第8外顯子未見陽性帶。唐衛(wèi)中等[5]應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對23例大腸正常黏膜組織、28例大腸腺瘤和75例大腸癌中PTEN蛋白表達進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)正常大腸黏膜與大腸腺瘤之間無明顯差異，而75例大腸癌中有24例蛋白丟失，43例蛋白表達低下，只有8例蛋白表達正常，總陽性率達68%(51/75)，與正常大腸黏膜及大腸腺瘤差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但Taniyama等[6]用RT-PCR和免疫組化方法在mRNA水平上檢測正常結(jié)腸黏膜組織、結(jié)腸腺瘤組織和癌組織檢測PTEN的表達，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸組織中均無PTEN丟失。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者標(biāo)本中PTEN蛋白的表達降低或缺失，且PTEN表達水平隨原發(fā)病灶的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移呈逐漸下降趨勢，這與Jiang等[7]的研究結(jié)果是一致的。表明隨著腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移，PTEN 蛋白表達下降。PTEN 能下調(diào)PIP3/ AKt途徑，誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF21)合成而致血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)合成增加。體內(nèi)外試驗表明，野生型PTEN過表達通過PIP3激酶信號傳導(dǎo)，增加VEGF介導(dǎo)的各種細胞反應(yīng)，增強細胞分裂、遷移等[8]。同時，PTEN表達缺失或降低能使金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)易于表達。Maehama等[9]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN 能使FAK去磷酸化，從而干擾細胞間的黏附性。而腫瘤細胞中PTEN丟失或表達下降，使MMPs及VEGF合成增加，導(dǎo)致腫瘤細胞向基質(zhì)浸潤和血管形成，形成腫瘤組織細胞的浸潤轉(zhuǎn)移，本研究結(jié)果支持以上觀點。

大腸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個有多種基因參與、相互作用的復(fù)雜過程。PTEN參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程，PTEN基因與結(jié)直腸癌臨床病理特征具有明顯相關(guān)性。PTEN基因有望成為結(jié)直腸癌基因治療的新靶點。

[1]周雋，吳強，楊楓.乳腺癌中PTEN表達及其臨床病理意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2003,19(2):162-164.

[2]Cantley LC, Neel BG. New insights into tumor suppression: PTEN suppresses tumor formation by restraining the phoshoinositide 3-kinase/AKt pathway[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999,96 (8): 4240-4245.

[3]Zheng LZ，Wang LW，Ajani J，et a1．Molecular basis of gastric cancer development and progression[J]. Gastric Cancer，2004,7(2):61-77．

[4]柯細松，曾昭淳，劉萬里.PCR-LIS-SSCP檢測大腸癌PTEN基因的點突變[J]. 實用癌癥雜志, 2002,17(1):28-30.

[5] 唐衛(wèi)中，高楓，唐宗江，等.大腸良惡性腫瘤PTEN/MMAC1/ TEP1腫瘤抑制基因的蛋白表達研究[J].大腸肛門病外科雜志, 2001,7(2) :9-13.

[6]Taniyama K，Goodison S，Ito R，et al. PTEN expression is maintained in sporadic colorectal tumors[J]. J Pathol, 2001,194 (3) :341-348.

[7]Jiang YA, Fan LF, Jiang CQ, et al. Expression and significance of PTEN, hypoxia-inducible factor-1 alpha in colorectal adenoma and adenocarcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2003,9(3): 491.

[8]Huang J, Kontos CD. PTEN modulates vascular endothelial growth factor-mediated singnaling and angiogenic effects [J]. J Biol Chem,2002,227 (13):10760-10766.

[9]Maehama T, Taylor GS, Dixon JE. PTEN and myotubularin: novel phosphoinositide phosphatases[J]. Ann Rev Biochem, 2001,70:247-279.