王瑞雪 彭 林 林書祥 王 維

天津地區(qū)嬰幼兒諾如病毒感染的分子流行病學(xué)特征

王瑞雪 彭 林△林書祥 王 維

目的：了解天津市地區(qū)嬰幼兒諾如病毒（NV）感染情況并對諾如病毒進(jìn)行基因分型分析。方法：收集2008年8月—2009年7月天津市兒童醫(yī)院門診和住院病毒性腹瀉患兒的糞便標(biāo)本。用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）法進(jìn)行檢測。測序后使用Bioedit和DNAstar基因分析軟件與GenBank中的參考株進(jìn)行同源性分析并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果：在540例腹瀉標(biāo)本中諾如病毒陽性的標(biāo)本為174例，諾如病毒的陽性率為32．22%，2008年11月NV陽性率較高，為62．22%。抽取7份陽性標(biāo)本進(jìn)行序列分析，結(jié)果7份標(biāo)本均為GⅡ－4型。結(jié)論：諾如病毒是天津地區(qū)嬰幼兒病毒性腹瀉的主要病原體之一，GⅡ－4型是主要流行株。

腹瀉,嬰兒 基因型 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 嵌杯病毒科 序列分析 天津

諾如病毒 （Norovirus，NV） 屬于杯狀病毒（Human calicivirus，HuCV），是世界范圍內(nèi)引起病毒性腹瀉的主要病原之一[1]。自1995年方肇寅等[2]首次在我國河南省急性腹瀉門診患兒便樣中發(fā)現(xiàn)了NV以來，我國各地相繼出現(xiàn)關(guān)于NV暴發(fā)和流行的報道。NV感染全年均可發(fā)生，冬季高發(fā)，人群普遍易感，可在人群中暴發(fā)，主要臨床表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉，病程一般呈自限性，傳播途徑以糞-口感染為主。本研究將天津市兒童醫(yī)院收集的病毒性腹瀉患兒糞便樣本540例進(jìn)行NV核酸型檢測，以了解天津地區(qū)嬰幼兒中NV的感染情況和基因型別。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2008年8月—2009年7月在兒童醫(yī)院就診的腹瀉患兒540例，男340例，女200例。年齡0.5個月～14歲，平均14個月。患兒大便呈水樣、蛋花樣或稀糊樣，次數(shù)較平時增多，伴或不伴發(fā)熱、嘔吐，有或無脫水。排除細(xì)菌、寄生蟲等感染性腹瀉和輪狀病毒檢測結(jié)果為陰性的腹瀉患兒糞便標(biāo)本。糞便檢測前-20℃保存。

1.2方法

1.2.1病毒RNA的提取 取糞便約350 μL，加生理鹽水補至1.5 mL,以5 000 r/min離心10 min，取糞便稀釋標(biāo)本的上清液300 μL加入500 μL Trizol（Invitrogen公司）,室溫放置5 min，再加入100 μL氯仿渦旋震蕩，4℃以12 000 r/min離心15 min。吸取上清液450 μL,將上清液移至新管，加冰異丙醇450 μL，顛倒混勻，室溫靜置 10 min。4℃以 12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入500 μL 75%冰乙醇懸浮沉淀，4℃以12 000 r/min離心15 min。棄去上清液，離心1 min，吸取上清液，棄去，室溫放10 min干燥。加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水30 μL，于 55℃～60℃溫育10 min，溶解RNA。

1.2.2引物設(shè)計 采用以諾如病毒RNA多聚酶高保守區(qū)為靶序列的引物P289/P290[3]。引物序列、位置及產(chǎn)物長度見表1。

表1 所用諾如病毒的引物序列

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） 采用杭州博日公司BioRT Two Step RT-PCR Kit試劑盒。逆轉(zhuǎn)錄體系：5×RT Buffer 2 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，Oligo－dT 0．5 μL，RNase抑制劑（40 U/μL）0．5 μL，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0．5 μL，實驗樣品5.5 μL。42℃ 45 min，95℃ 5 min，冰浴 5 min。PCR 反應(yīng)體系：10×RT Buffer（含 Mg2＋）2．5 μL，dNTP（10 mmol/L）0．5 μL，上游引物（5 μmol/L）0.5 μL，下游引物（5 μmol/L）1 μL，Taq 混合DNA 聚合酶 0．5 μL，RT 產(chǎn)物 2．5 μL，dd H2O 18 μL，總體積為25 μL，輕微離心后，放入PCR儀中擴增。反應(yīng)條件：94℃3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)，最后 72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自加拿大新產(chǎn)業(yè)公司。

1.2.4測序及分析 隨機抽取7份NV陽性標(biāo)本的PCR產(chǎn)物送天根生化科技有限公司進(jìn)行序列測定。利用Bioedit和DNAstar對所獲得的序列進(jìn)行核苷酸同源性和基因親緣性分析，參比序列均來自GenBank。

2 結(jié)果

2.1NV感染情況 540份標(biāo)本中有174例在319 bp處出現(xiàn)NV特異性擴增條帶，陽性率為32.22%。2008年11月NV陽性率較高，為62.22%，各月份NV陽性率見圖1。

圖1 2008年8月—2009年7月嬰幼兒腹瀉糞便標(biāo)本NV陽性率

2.2NV同源性分析 見圖2、3。將7份NV陽性標(biāo)本的核苷酸序列與NV各基因型進(jìn)行對比。其基因型編號分別為：m87661（Norwalk，GⅠ－1型），l07418（Southampton，GⅠ－2 型），u044669（Desert Shield，GⅠ－3 型），ab042808（Chiba，GⅠ－4 型），x81879（Melksham，GⅡ－1 型），u22498（Mexico，GⅡ－3型），ay502023（Farmington Hill，GⅡ－4型）。結(jié)果顯示，所測的 7個序列與 ay502023（Farmington Hill，GⅡ－4型）的參考株堿基序列同源性較其他基因型高，同源性在86．7%～96．1%之間。將所測的7個序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析，樣本1與Beijing/49/2007（eu703697，GⅡ型）、Ehime5（ab447455，GⅡ－4 型）、Toyama5（ab447445，GⅡ－4型）較為接近，同源性分別為94.5%、93.5%、95.6%。樣本2與Beijing/282/2005株（eu703670，GⅡ型）最為接近，同源性達(dá)98．8% 。 樣 本 3、5、6 與 Beijing/133/2007 株（eu703706，GⅡ型）同源性在95%以上。樣本4與Beijing/133/2007株（eu703706 GⅡ型）的同源性在90%以上。樣本7與Beijing/49/2007（eu703697,GⅡ型）、Beijing/96/2007（eu703701，GⅡ型）的同源性在96%以上。所測的7個序列屬于NV的GⅡ-4型，7個序列與參考序列ay502023的部分核苷酸差異。

圖2 天津地區(qū)NV株RdRp遺傳序列進(jìn)化樹

圖3 所測序列與ay502023部分序列變異比較

3 討論

NV是急性胃腸炎的主要病原，其為單股正鏈小RNA病毒，無包膜，具有20面體結(jié)構(gòu)，直徑26～30 nm。NV全長7 400～7 700 bp，分為3個開放閱讀框架（opening reading frame,ORF），其中，ORF1編碼一個具有保守序列的多聚酶非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2編碼一種分子質(zhì)量約為56 kb的衣殼蛋白，ORF3編碼一種約為22.5 kb的微小結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白的作用與功能尚不清楚。NV基因組中ORF1的RNA多聚酶區(qū)相對保守，其他區(qū)域變異相對較多，所以此區(qū)常被用來進(jìn)行基因分型。NV可分為5個基因型，其中GⅠ、GⅡ、GⅣ組易感染人。Kageyama等[4]通過分析衣殼蛋白VP1基因的S區(qū)把GⅠ和GⅡ進(jìn)一步分別分為14個和17個基因型，GⅡ-4型在世界范圍內(nèi)廣泛流行。

發(fā)展中國家每年因NV感染而住院的患者多達(dá)110萬例，小于5歲的死亡嬰幼兒達(dá)20萬例。在發(fā)達(dá)國家每年因NV感染而住院的患者6.4萬例，門診患者 90 萬例[5]。我國的濟(jì)南[6]、上海[7]和北京[8]等地也有關(guān)于NV感染和流行的報道，NV檢出率在16.85%～38.27%之間。

GⅡ-4型是全球NV的主要流行型[9]，且GⅡ-4型不斷出現(xiàn)新的變異基因型,也是其近年來出現(xiàn)較大范圍流行的原因之一。此次檢測并測序的7份標(biāo)本均為GⅡ-4型，這與國際流行趨勢符合。7份標(biāo)本的核苷酸序列與北京 2005、2007年公布于GenBank數(shù)據(jù)庫的NV GⅡ-4型遺傳組序列最為接近。這可能和天津與北京地理位置相鄰，兩地人員流動性較大有關(guān)。所測的7株NV核苷酸序列與日本 2006年的 Ehine5株 （ab447455），2006年的Toyama5（ab447445）同源性在 80.1%～96.9%，而根據(jù)Guo等[10]的報道Ehime5是2004—2005年日本NV的主要流行株之一。這是否提示有日本流行株流入北京、天津，還需進(jìn)一步研究和觀察。

本次監(jiān)測中，NV陽性率在2008年11月—2009年2月較高，其中2008年11月NV陽性率最高。這可能與NV的增長與寒冷、人群免疫力低及新GⅡ-4抗原毒株出現(xiàn)有關(guān)[11]。此外，在2009年6月意大利發(fā)生的NV性胃腸炎中還同時檢測出8例混合感染有輪狀病毒[12]。在本次檢測中亦發(fā)現(xiàn)1例輪狀病毒陽性標(biāo)本檢測出現(xiàn)NV陽性結(jié)果，但此標(biāo)本尚未測序。是否存在混合感染仍需進(jìn)一步關(guān)注。

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Characterization of Molecular Epidemiology of Norovirus Infection in Infants and Young Children in Tianjin

WANG Ruixue，PENG Lin，LIN Shuxiang，WANG Wei

Tianjin Children’s Hospital,Tianjin 300074,China

Objective:To understand the charaterization of Norovirus(NV)infection in infants and young children in Tianjin area,and study the genotype and the genetic identity of NV.Methods:The fecal specimens were collected from infants and young children with viral gastroenteritis from Tianjin Children’s Hospital from August 2008 to July 2009.The viral RNA was amplified by a reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).The amplified genes were sequenced and compared with the NV sequences deposited in GeneBank.The sequence homology was evaluated and the phylogenetic tree was generated by DNAstar and Bioedit software.Results:One hundred and seventy-four positive samples of NV were detected in 540 specimens.The positive rate was 32.22%.There was a higher NV positive rate(62.22%)in November 2008.Seven NV positive samples were selected and sequenced,showing that NV strains all belonged to GⅡ-4.Conclusion:Norovirus is one of the important diarrhea pathogens of viral gastroenteritis in infants and young children in Tianjin area and the GⅡ-4 is the major prevalent strain.

diarrhea,infantile genotype reverse transcriptase polymerase chain reaction caliciviridae sequence analysis TIANJIN

300074 天津市兒童醫(yī)院（王瑞雪，彭林）；天津市兒童醫(yī)院兒研所（林書祥，王維）

△通訊作者 E-mail：lpengfch@yahoo.com

（致謝：本次研究得到了天津市兒童醫(yī)院兒研所及預(yù)防科各位老師的大力支持，特此表示由衷的感謝）

（2010-02-02收稿 2010-04-22修回）

（本文編輯 閆娟）

短篇與病例報告