劉莎莎 林靜娜 馮 憑

天津地區(qū)漢族人群E-選擇素A561C基因多態(tài)性與2型糖尿病相關(guān)性研究

劉莎莎 林靜娜 馮 憑

目的：探討E-選擇素基因A561C多態(tài)性與天津地區(qū)漢族人群2型糖尿?。═2DM）的關(guān)系。方法：利用試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取DNA后，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測(cè)112例T2DM和健康體檢者140例（對(duì)照組）A561C多態(tài)性，并采用微粒子化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析法和全自動(dòng)生化儀檢測(cè)臨床生化指標(biāo)。結(jié)果：在112例T2DM患者中，檢出12例雜合子突變基因型（AC），C等位基因頻率為5.36%；在140例對(duì)照組中，檢出4例AC，C等位基因頻率為1.43%，2組均未檢出突變純合子（CC），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；以基因型分組，112例T2DM患者中AC組空腹血糖（FPG）和餐后2 h血糖（P2PG）值均高于AA組，空腹血胰島素（FINS）低于AA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：C等位基因可能為天津地區(qū)漢族人群T2DM易感基因，E-選擇素基因多態(tài)性在T2DM的發(fā)生與發(fā)展中有一定作用。

糖尿病，2型 E選擇素 多態(tài)現(xiàn)象,遺傳 基因型 基因頻率 天津 漢族

目前，全球約有2億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2025年將增至3.3億[1]。糖尿病是心腦血管疾病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，糖尿病及其并發(fā)癥的防治已經(jīng)成為全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，E-選擇素高表達(dá)與高血糖[2]、遺傳[3]等因素相關(guān)。本研究對(duì)E-選擇素基因表皮生長(zhǎng)樣區(qū)561位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，探討其與天津地區(qū)漢族人群2型糖尿?。═2DM）的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2005年7月—12月門(mén)診無(wú)血緣關(guān)系T2DM患者112例（T2DM組），男53例，女 59 例，平均年齡（47．3±7．6）歲。選取同時(shí)期健康體檢者為正常對(duì)照組，相互之間無(wú)血緣關(guān)系，共140例，男82例，女58 例，平均年齡（46．7±7．5）歲，2 組人群均為中國(guó)北方天津地區(qū)漢族人，T2DM的診斷依據(jù)WHO1999年標(biāo)準(zhǔn)。2組間性別（χ2=1.781）、年齡（t=1.576）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P>0.05）。2組均測(cè)量收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）和體質(zhì)量指數(shù)（BMI）。禁食12 h后，取次日空腹肱靜脈血5 mL備用。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[4]，由大連寶生物公司合成序列如下。上游引物:5′-AGTAATAGTCCTCCTCATCATG-3′；下游引物:5′-ACCATCTCAAGTGAAGAAAGAG-3′。

1.2.2全血DNA的提取 試劑盒法提取全血DNA，試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。

1.2.3聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） PCR體系總體積50 μL，其中10 倍 PCR 緩沖液 5 μL，Taq DNA 聚合酶 0.6 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，上、下游引物各 2 μL（20 pmol），模板 DNA 5 μL，體積不足由滅菌純凈水補(bǔ)充，放于熱循環(huán)擴(kuò)增儀（德國(guó)Eppendorf公司，PE-9700型）：94℃預(yù)變性5 min，后進(jìn)行94℃變性30 s，61℃退火 60 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35次。末次循環(huán)后，72℃延伸5 min，之后放于4℃保存。

1.2.4擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 PCR產(chǎn)物10 μL，限制性內(nèi)切酶 PstUⅠ（大連寶生物公司）1.8 μL，緩沖液2 μL，體積不足由滅菌純凈水補(bǔ)充，反應(yīng)體系放于37℃水浴5 h，取8 μL產(chǎn)物與0.8 μL上樣緩沖液混合，加樣于1%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)上照相保存。

1.2.5生化檢測(cè) 采用微粒子化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析法檢測(cè)空腹血胰島素（FINS）。采用日立公司7170A全自動(dòng)生化儀檢測(cè)空腹血糖（FPG）、餐后2 h血糖（P2PG）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)?；蚍植计胶庑詸z驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)判定基因分布是否符合Hardy-Weinberg定律，單個(gè)基因型及組間等位基因的頻率比較采用四格表χ2檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1基因型分析 本試驗(yàn)?zāi)康幕驗(yàn)?86 bp，酶切后AA基因型為123 bp和63 bp的兩條帶；突變型純合子（CC型），電泳后為一條帶；而突變型雜合子（AC型）產(chǎn)生186 bp、123 bp和63 bp共3個(gè)條帶，見(jiàn)圖1。2.2遺傳平衡檢驗(yàn)及基因型和等位基因頻率的分布 T2DM組和對(duì)照組基因型分布符合Hardy-Weinberg定律（均P>0.05），見(jiàn)表1。2組間基因型和A561C等位基因頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表 2。

圖1 酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

表1 E-selectin基因A561C突變遺傳平衡性檢驗(yàn)（例）

表2 2組基因型和等位基因頻率分布的比較

2.3DM患者中不同基因型各項(xiàng)指標(biāo)比較 AC組FPG和P2PG均高于AA組，F(xiàn)INS低于AA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。AC組TC、TG和BMI較AA組高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同基因型的臨床資料（±s）

表3 不同基因型的臨床資料（±s）

*P ＜ 0．05，**P ＜ 0．01

AA AC t 100 12 SBP（mm Hg）114±16 113±9 0.278 DBP（mm Hg）76±8 76±8 0.045 BMI（kg/m2）24.41±2.47 24.45±2.08 0.058 TC（mmol/L）4.7±0.7 5.0±0.6 1.62 TG（mmol/L）1.43±1.00 1.63±1.07 0.774組別 n HDL-C（mmol/L）1.50±0.37 1.45±0.34 0.559 AA AC t 100 12 LDL-C（mmol/L）2.56±0.59 2.48±0.78 0.523 FPG（mmol/L）6.31±2.05 7.83±2.18 2.841**P2PG（mmol/L）8.87±2.78 10.65±2.65 2.484*FINS（mIU/L）8.38±2.36 7.90±1.86 1.991*組別 n

3 討論

T2DM占所有糖尿病的95%以上，遺傳因素在T2DM人群中起著重要的作用。因此，尋找與其相關(guān)及致病的基因已成為國(guó)內(nèi)外近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。目前只有少數(shù)單基因形式T2DM的致病基因被找到。

E-選擇素發(fā)現(xiàn)于1985年，基因全長(zhǎng)約13 kb，位于第1號(hào)染色體長(zhǎng)臂，由14個(gè)外顯子及13內(nèi)含子組成，其中第4外顯子編碼E-選擇素表皮生長(zhǎng)樣結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域的缺失將減弱E-選擇素介導(dǎo)的黏附作用。Wenzel等[5]首先證實(shí)了E-選擇素第4外顯子的561位存在A→C的突變，并導(dǎo)致所編碼的第128位氨基酸由絲氨酸變成精氨酸（Ser128Arg）。此多態(tài)性可能影響E-選擇素的基因表達(dá)和功能，與一些疾病的發(fā)生、發(fā)展有一定的關(guān)聯(lián)[6]。英國(guó)學(xué)者首先報(bào)道E-選擇素A561C多態(tài)性與英國(guó)白種人T2DM相關(guān)[7]，國(guó)內(nèi)武漢報(bào)道E-選擇素A561C多態(tài)性與湖北地區(qū)漢族人群T2DM相關(guān)，但E-選擇素基因型間血糖血脂水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。本研究運(yùn)用PCR-RFLP分析檢測(cè)C等位基因?yàn)樘旖虻貐^(qū)漢族人群T2DM易感基因，E-選擇素基因型間FPG、P2PG和FINS有一定的差異，這與以前國(guó)內(nèi)報(bào)道有所不同。同時(shí)，國(guó)外學(xué)者Ellsworth等[9]研究表明，E-選擇素基因多態(tài)性頻率分布有明顯的種族、地區(qū)差異，E-選擇素中C等位基因頻率在美國(guó)、德國(guó)、英國(guó)人群中分布分別為15.4%、8.7%和11.4%。我國(guó)C等位基因頻率明顯低于西方國(guó)家人群，文獻(xiàn)報(bào)道僅為2.6%[8]，本研究顯示T2DM組和對(duì)照組整體C等位基因頻率3.1%，說(shuō)明不同種族基因突變頻率存在顯著差異，這些種族差異可能是中國(guó)與西方國(guó)家糖尿病致病和易感基因有所不同。

綜上所述，從分子水平了解E-選擇素基因多態(tài)性在我國(guó)人群中的分布，可以探討不同基因在T2DM的發(fā)病及其發(fā)展中的交互作用，進(jìn)一步從遺傳學(xué)的角度，在分子水平闡明的發(fā)病機(jī)制，擴(kuò)展人們對(duì)T2DM的認(rèn)識(shí)，為T(mén)2DM的預(yù)防、判斷預(yù)后提供理論依據(jù)和新的思路，為基因治療提供新的靶點(diǎn)，還可以對(duì)異常家系進(jìn)行早期干預(yù)，以預(yù)防或延緩T2DM的發(fā)生和發(fā)展。

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Relativity Study between the E-Selectin Gene A561C Polymorphism and Diabetes Mellitus in Chinese Han Population of Tianjin

LIU Shasha，LIN Jingna，F(xiàn)ENG Ping

Tianjin People’s Hospital，Tianjin 300121，China

Objective:To investigate the relationship between E-selectin gene A561C polymorphism and type 2 diabetes mellitus （T2DM）.Methods：Using PCR-RFLP way,the A561C polymorphism was screened in 112 patients with T2DM and 140 controls.The clinical data were analyzed.Results：Twelve patients with the heterozygote mutation(AC)were found in 112 T2DM patients,and C allele frequency was 5.36%.Four were found in 140 controls,and C allele frequency was 1.43%.There was a significant difference between the two groups(P＜0.05).No homozygote mutation(CC)was found in the two groups.The levels of fasting plasma glucose(FPG)and 2 h postprandial blood glucose(P2PG)were higher in T2DM patients of AC group than those of AA group.The level of fasting insulin(FINS)was significantly lower in T2DM patients of AC group than that of AA group(P＜0.05).Conclusion:C allele may be the T2DM-susceptibility gene in Chinese Han population of Tianjin.E-selectin gene polymorphism plays an important role in occurrence and development of diabetes mellitus.

diabetes mellitus,type 2 E-selectin polymorphism,genetic genotype gene frequency TIANJIN HAN NATIONALITY

300121 天津市人民醫(yī)院（劉莎莎，林靜娜）；天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院（馮憑）

（2010-01-25收稿 2010-06-05修回）

（本文編輯 魏杰）