周光朝,劉良忠,萬(wàn) 菡,李丁寧,劉培勇

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

魚鱗酶解前處理工藝優(yōu)化研究

周光朝,劉良忠,萬(wàn) 菡,李丁寧,劉培勇

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

以草魚魚鱗為原料優(yōu)化魚鱗脫鈣、脫雜蛋白前處理工藝。通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn),分別以魚鱗脫鈣率及膠原蛋白含量為指標(biāo),研究最佳魚鱗酶解前處理工藝條件。結(jié)果表明,脫鈣工藝中 HCl濃度 0.4mol·L-1、料液比 1∶20、脫鈣時(shí)間 6 h可得到較高的脫鈣率;最佳除雜蛋白工藝參數(shù)為 NaOH濃度 0.15 mol·L-1、料液比 1∶20、脫雜蛋白時(shí)間 12 h。

魚鱗,脫鈣,脫雜蛋白,膠原蛋白

2007年中國(guó)水產(chǎn)品總量為 4747.5萬(wàn) t,其中內(nèi)陸水產(chǎn)品達(dá) 2196.6萬(wàn) t,內(nèi)陸魚類產(chǎn)品總量為 1908.48萬(wàn) t[1]。然而據(jù)統(tǒng)計(jì),每年廢棄的淡水魚魚鱗超過(guò) 30萬(wàn) t。研究發(fā)現(xiàn)魚鱗中膠原蛋白含有豐富的甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸,其水解產(chǎn)物中還存在具有生理活性的肽[2-4]。這些特性使膠原蛋白及其水解產(chǎn)物在醫(yī)療、保健及美容方面具有良好的應(yīng)用前景[5]。

魚鱗主要由表層的鈣化層和內(nèi)部的膠原纖維層構(gòu)成,為了得到高品質(zhì)的膠原蛋白肽產(chǎn)品,首先要脫除魚鱗表面的鈣化層以及魚鱗中的雜蛋白。本文擬研究魚鱗脫鈣脫雜蛋白的前處理工藝,為魚鱗前處理工藝提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚魚鱗,由洪湖德炎水產(chǎn)食品有限公司提供,魚鱗清洗去除黏著的魚皮、雜質(zhì),再經(jīng) 45℃烘干后粉碎魚鱗過(guò) 40目篩備用。

1.2 儀器

SX2-4-10箱式電爐 (上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司);754N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (上海精密科學(xué)儀器有限公司);DS-1高速組織搗碎機(jī) (上海精科實(shí)業(yè)有限公司);FZ102微型植物粉碎機(jī) (中國(guó)天津泰斯特儀器有限公司);KDN-08C數(shù)顯溫控消化爐(上海新嘉電子有限公司)。

1.3 試劑

L-羥脯氨酸 (sigma),鹽酸、硫酸、高氯酸、檸檬酸、硼酸、氫氧化鈉、氯胺 T、乙二醇獨(dú)甲醚、對(duì)二甲基氨基苯甲醛、乙醚等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 原料成分的測(cè)定：

水分含量測(cè)定：烘干法,GB/T 5009.3—2003;

粗蛋白含量測(cè)定：凱氏定氮法,G B/T 5009.5—2003;

脂肪含量測(cè)定：索氏抽提法,G B/T 5009.6—2003;

膠原蛋白含量測(cè)定：根據(jù)羥脯氨酸氯胺 T比色法測(cè)定[6],膠原蛋白與羥脯氨酸轉(zhuǎn)換系數(shù)為 9.75。

1.4.2 魚鱗前處理工藝方法

取干燥魚鱗粉末 4 g(40目),加入一定濃度的HCl溶液,在一定 pH下勻速攪拌一定的時(shí)間,蒸餾水洗滌魚鱗至中性,再用一定濃度的NaOH溶液浸泡處理魚鱗一定時(shí)間,蒸餾水洗滌至中性即可。脫鈣效果以灰分脫除情況來(lái)表示,以膠原蛋白含量作為評(píng)價(jià)前處理脫雜蛋白工藝指標(biāo)。先做單因素實(shí)驗(yàn),再根據(jù)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)以優(yōu)化前處理工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照 1.4.1的方法,確定羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度和吸光度值的關(guān)系 (見(jiàn)圖1)。

圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 草魚魚鱗基本成分 (表1)

表1 草魚魚鱗組成成分 /%

2.3 魚鱗脫鈣工藝

2.3.1 鹽酸濃度對(duì)魚鱗脫鈣的影響

準(zhǔn)確稱取 4g魚鱗,分別用 0.2 mol·L-1,0.4 mol·L-1,0.6 mol·L-1,0.8 mol·L-1鹽酸溶液以 1∶15的料液比勻速攪拌脫鈣 1,2,4,6,8 h。由圖2可知,鹽酸濃度越高,脫鈣效果就越好。當(dāng)鹽酸濃度為 0.4 mol·L-1時(shí),脫鈣 6 h,脫鈣率高達(dá)95.77%。HCl濃度越大,脫鈣液中羥脯氨酸的濃度也越大,由 HCl引起的膠原蛋白水解越多[7-8]。

圖2 鹽酸濃度對(duì)魚鱗脫鈣的影響

2.3.2 不同料液比對(duì)魚鱗脫鈣的影響

準(zhǔn)確稱取 4g魚鱗,用 0.4 mol·L-1鹽酸在料液比為 1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30,1∶35浸泡魚鱗 4 h。由圖3可知,隨著魚鱗和鹽酸料液比增加,脫鈣率隨之增加,高于 1∶20料液比脫鈣率變化不大。

圖3 料液比對(duì)魚鱗脫鈣的影響

2.3.3 浸泡時(shí)間對(duì)魚鱗脫鈣的影響

準(zhǔn)確稱取 4 g魚鱗,分別用 0.4 mol·L-1鹽酸在料液比為 1：20浸泡魚鱗 1 h,2 h,3 h,4 h,4.5 h,5 h,5.5 h,6 h,6.5 h,7 h,8 h。由圖4可知,當(dāng)脫鈣時(shí)間 ＜1 h時(shí),脫鈣率增加很快,隨著鹽酸脫鈣時(shí)間的增加,脫鈣率增加幅度逐漸減少,脫鈣 6 h后,魚鱗脫鈣率增加變化不大。

圖4 浸泡時(shí)間對(duì)魚鱗脫鈣的影響

2.3.4 脫鈣工藝正交試驗(yàn)

由正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析,見(jiàn)表3?？梢钥闯鯤Cl脫鈣時(shí)間按影響最大,其次是料液比對(duì)脫鈣效果,HCl濃度的影響較小,最佳的脫鈣工藝條件為B3A3C3,HCl濃度為 0.4 mol·L-1,料液比 1∶20,時(shí)間為 6 h。時(shí)間的影響最顯著,這恰恰表明在 HCl溶液脫鈣條件下延長(zhǎng)脫鈣時(shí)間可以達(dá)到好的脫鈣效果。

表3 HCl脫鈣正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 魚鱗除蛋白工藝

魚鱗中膠原纖維分子間和分子內(nèi)交聯(lián)的共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵使其結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定,需進(jìn)行堿處理以打破上述的穩(wěn)定結(jié)構(gòu),使原膠原分子得以釋放,同時(shí)除去魚鱗中的非膠原雜蛋白,以提高膠原蛋白純度。本試驗(yàn)選擇NaOH溶液來(lái)脫除魚鱗中的雜蛋白[9]。

2.4.1 不同浸堿濃度的影響

經(jīng)脫鈣處理后的魚鱗分別用不同濃度的NaOH溶液以 1∶20料液比處理 9 h,并測(cè)魚鱗中膠原蛋白含量。由圖5可知,膠原蛋白含量隨 NaOH溶液濃度升高而升高,當(dāng) NaOH濃度為 0.1 mol·L-1時(shí)達(dá)到最高,提高 NaOH濃度,膠原蛋白含量反而下降。膠原蛋白含量在出現(xiàn)最大值以前的區(qū)間隨浸堿濃度升高而提高的原因在于料液比和浸堿時(shí)間一定時(shí),浸堿濃度越高對(duì)魚鱗中雜蛋白的脫除效果越好,從而膠原蛋白的含量越高;而后降低的原因在于浸堿濃度過(guò)高會(huì)使魚鱗中的膠原蛋白發(fā)生溶解,從而造成損失。

圖5 浸堿濃度對(duì)魚鱗膠原蛋白的影響

2.4.2 不同浸堿料液比的影響

圖6 浸堿料液比對(duì)魚鱗膠原蛋白的影響

經(jīng)脫鈣處理后的魚鱗用 0.1 mol·L-1NaOH溶液分別以料液比 1∶10,1∶15,1∶20,1∶25處理 9 h,并測(cè)魚鱗中膠原蛋白含量。由圖6可知,膠原蛋白含量隨料液比的升高而升高,料液比為 1∶20時(shí)可達(dá)到較高的膠原蛋白含量。浸堿濃度、浸堿時(shí)間一定時(shí),魚鱗中雜蛋白脫除隨料液比的增大而增大,從而對(duì)膠原蛋白的釋放和提取有利,但料液比過(guò)大會(huì)使魚鱗中的膠原蛋白發(fā)生溶解,從而發(fā)生損失。

2.4.3 不同浸堿時(shí)間的影響

經(jīng)脫鈣處理后的魚鱗用 0.1 mol·L-1NaOH溶液以 1∶20料液比分別處理 3 h,6 h,9 h,12 h,18 h,24 h,并測(cè)魚鱗中膠原蛋白含量。圖7可知,浸堿時(shí)間越長(zhǎng),膠原蛋白的含量越高,當(dāng)浸堿時(shí)間達(dá)到 9 h時(shí),膠原蛋白含量為 96.56%,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),膠原蛋白含量反而有所下降。這是由于浸堿時(shí)間越長(zhǎng),膠原蛋白會(huì)溶解在浸堿液中,造成膠原蛋白損失。

圖7 浸堿時(shí)間對(duì)魚鱗膠原蛋白的影響

2.4.4 脫雜蛋白正交試驗(yàn)

由正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析,見(jiàn)表4。可以看出NaOH濃度對(duì)脫雜蛋白效果影響最大,其次是料液比的影響,時(shí)間的影響較小,最佳的脫雜蛋白工藝條件為 A3B3C3,NaOH濃度為 0·15 mol·L-1,料液比1∶20,時(shí)間為 12 h。時(shí)間的影響最不顯著,這恰恰表明在NaOH脫雜蛋白條件下即使在短時(shí)間內(nèi)也可以達(dá)到好的脫雜蛋白效果。

表4 NaOH溶液脫雜蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

3 結(jié)論

采用草魚魚鱗的最佳脫鈣工藝條件為：HCl濃度 0.4 mol·L-1、料液比 1∶20、脫鈣時(shí)間 6 h;脫雜蛋白工藝條件為：NaOH濃度 0.15 mol·L-1、料液比1∶20、脫雜蛋白時(shí)間 12 h。在此工藝條件下,魚鱗前處理工藝可縮短到 1d完成,而且得到的魚鱗膠原蛋白純度較高,品質(zhì)最佳。

[1] 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局.中國(guó)漁業(yè)年鑒 [M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2008.

[2] Falguni Pati,Basudam Adhikari,Santanu Dhara.Isolation and characterization offish scale collagen of higher thermal stability[J].Bioresource Technology,2009,12(133)：1-6.

[3] Masahiro Ogawa,Ralph Portier J,Michael Moody W,et al.Biochemical properties of bone and scale collagens isolated from the subtropical fish black drum(Pogonia cromis)and sheep sheadseabream(Archosargus probatocephalus) [J]. Food Chemistry,2004(88)：495-501.

[4] Wang Lin,An Xinxin,Yang Fengmei,et al.Isolation and characterisation of collagens from the skin,scale and bone of deep-sea redfish(Sebastesmentella)[J].Food Chemistry,2008108：616-623.

[5] Karim A.A.,Rajeev Bhat. Fish gelatin：properties,challenges,and prospectsasan alternative to mammalian gelatins[J]. Food Hydrocolloids,2009(23)：563– 576.

[6] 張俊杰,曾慶孝.魚鱗中羥脯氨酸的測(cè)定[J].淮海工學(xué)院學(xué)報(bào),2004,13(1)：53-55.

[7] 張俊杰,段蕊,薛婉麗,等.鯉魚魚鱗在鹽酸脫鈣過(guò)程中的變化[J].氨基酸和生物質(zhì),2009,31(1)：44-47.

[8] 張俊杰,曾慶孝.魚鱗鹽酸脫鈣過(guò)程中膠原蛋白含量的變化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(4)：40-43.

[9] Takeshi Nagai,Masami Izumi,Masahide Ishii.Fish scale collagen.Preparation and partial characterization[J]. International Journal of Food Science and Technology,2004(39)：239-244.

Study on optimizing pretreatment conditions of fish scales before enzymatic hydrolysis

ZHOU Guang-chao,LIU Liang-zhong,WAN Han,LI Ding-ning,LIU Pei-yong
(College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

In this paper,the optimal pretreatment conditions of fish scales before enzymatic hydrolysis was investigated through single effecting factors and orthogonal tests by the ratios of fish scales decalcification rate and the contents of collagen.The best HCl concentration,decalcifying time,and the ratio of solid material to liquid material for decalcification are 0.4 mol·L-1,1 to 20,and 6 hour respectively.And the best conditions of taking off noncollagenous proteins was NaOH 0.15 mol·L-1,the ratio of solid material to liquid material 1∶20,taking off non collagenous proteins's time 12h.

fish scales;decalcification,taking off noncollagenous proteins;collagen

TS 254.9

A

1009-4881(2010)03-0007-04

10.3969/j.issn.1009-4881.2010.03.003

2010-06-06.

周光朝 (1985-),男,碩士研究生,E-mail：zhou_423yan@yahoo.com.cn.

劉良忠 (1963-),男,教授,E-mail：liu202288@163.com.

湖北省教育廳高校產(chǎn)學(xué)研合作資助項(xiàng)目(C2010040);武漢工業(yè)學(xué)院研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助(08cx010).