張有發(fā)，王普

1(浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州，310032)2(湖南金農生物資源股份有限公司，湖南長沙，410100)

茶葉中的兒茶素屬黃烷醇類化合物，占茶葉干重的12%～24%。兒茶素分子結構中含沒食子酰基的稱為酯型兒茶素或復雜兒茶素，主要有表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG);不含沒食子?；姆Q為非酯型兒茶素或簡單兒茶素，主要組成有表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素(DL-C)和表兒茶素(EC)。以EGCG為代表的酯型兒茶素占兒茶素總量的80%左右，具有較強的苦澀味，收劍性強，限制了兒茶素在袋泡茶、強化兒茶素飲料等領域中的應用。以EGC為代表的非酯型兒茶素苦澀味低，收劍性弱，回味爽口。如能提高非酯型兒茶素的比例，制作成低苦澀味產品，則可填補該應用領域的空白，前景十分廣闊。

采用外源單寧酶降解酯型兒茶素為簡單兒茶素，可得低苦澀味的產品［1－2］，但單寧酶未被列入食品添加劑使用衛(wèi)生標準GB2760－2007目錄中，不是合法的添加劑，不能用于食品。文獻報道的工藝研究主要集中在如何富集以EGCG為代表的酯型兒茶素和分離咖啡因(CAF)方面［3－10］，也有文獻報道通過控制提取溫度與提取時間來富集 EGC［11－12］，但均不脫除EGCG，且由于產品中的酯型兒茶素比例較高，苦澀味仍過重。本文以綠茶多酚(TP)為原料，EGC含量為指標，采用大孔吸附樹脂處理，研究低苦澀味兒茶素制備新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶多酚40%:EGC含量6.22%，總兒茶素含量21.6%，由湖南金農生物資源股份有限公司提供;兒茶素標準品(CAF、EGC、DL-C、EC、EGCG、GCG 和ECG):由日本三井農林株式會社提供;甲醇(色譜純)，冰醋酸(分析純)，甲酰胺(分析純)，重蒸水。

HP-20，SP70大孔吸附樹脂(日本三菱化學公司);DM-130，DM-131大孔吸附樹脂(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司);HPD-722大孔吸附樹脂(滄州保恩化工有限公司);HZ011大孔吸附樹脂(上海華震科技有限公司);Seplite Lx-60和Seplite LSA-7大孔吸附樹脂(西安藍曉科技特種樹脂廠);ADS-17大孔吸附樹脂(天津南開合成科技有限公司)。

1.2 試驗儀器與設備

高效液相色譜儀(Waters)，分析天平(METTLER TOLEDO)，旋轉蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)，真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠)。

1.3 樹脂預處理

大孔吸附樹脂用體積分數(shù)95%乙醇浸泡溶脹12 h，然后裝于玻璃層析柱中，用95%的乙醇淋洗，待流出液1 mL用5 mL純水稀釋不渾濁時改用重蒸水淋洗，洗至無明顯乙醇氣味，低溫干燥至恒重后備用。

1.4 分析方法

兒茶素含量測定采用HPLC法。色譜柱:Shimpack，ODS C185 μm，4.6 ～150 mm，波長:278 nm，流動相A:水，B:V(甲酰胺)∶V(甲醇)∶V(冰醋酸)=40∶2∶1.5，流速:1.1 mL/min，進樣量:10 μL。

HPLC梯度條件

1.5 試驗方法

1.5.1 以EGC/EGCG比值為指標進行樹脂的篩選

準確稱取經60℃干燥至恒重的不同型號樹脂5.0 g置250 mL錐形瓶中，加入100 mL質量濃度為30 g/L的茶多酚水溶液，室溫振蕩平衡4 h，測定平衡濃度;將吸附平衡后的樹脂抽濾，重蒸水淋洗樹脂直至抽濾液為無色，然后將樹脂轉移至250 mL錐形瓶中，加入體積分數(shù)85%乙醇水溶液100 mL，室溫振蕩平衡1 h，測定平衡濃度。

樹脂吸附量/(mg·g－1)=溶液體積(mL)×［吸附前質量濃度(mg/mL)–吸附后質量濃度(mg/mL)］/樹脂質量(g)

解吸率/%=洗脫液的平衡質量濃度(mg/mL)×洗液體積(mL)/［樹脂質量(g)×吸附量(mg/g)］×100

1.5.2 茶多酚濃度對吸附率的影響

準確稱取經60℃干燥至恒重的樹脂5.0 g置250 mL錐形瓶中，各加入100 mL質量濃度分別為10、30、50、70和100 g/L的茶多酚水溶液，室溫振蕩平衡4 h，測定平衡濃度，考察茶多酚濃度對樹脂吸附量和吸附率的影響。

1.5.3 等溫吸附曲線

以質量濃度為30 g/L的茶多酚溶液為試驗對象，考察其在室溫下的靜態(tài)吸附動力學過程，得到靜態(tài)吸附曲線。

1.5.4 大孔樹脂動態(tài)吸附穿透曲線

選用Φ50 mm×500 mm層析柱，柱體積為500 mL，將質量濃度為30 g/L的茶多酚溶液5 000 mL以1 500 mL/h的流速(3 BV)通過吸附柱，每500 mL(1 BV)收集一個點樣，采用HPLC法檢測EGC濃度，考察穿透曲線。

1.5.5 吸附樹脂的動態(tài)酒精梯度脫附

將上述動態(tài)吸附后的樹脂用重蒸水洗去水溶性雜質，至流出液澄清，然后用體積分數(shù)10%、30%、50%、70%和90%乙醇水溶液各1 000 mL脫附，分別收集不同體積分數(shù)的乙醇脫附液，采用旋轉蒸發(fā)儀進行減壓濃縮，60℃真空干燥，稱重，采用HPLC法檢測咖啡因及兒茶素含量。

2 結果與討論

2.1 樹脂的篩選結果

大孔吸附樹脂主要是通過吸附劑與吸附物質分子間作用力而實現(xiàn)的物理吸附。由于不同樹脂的極性、孔徑和表面積等物理化學性質的不同，導致其對不同物質的選擇性能不同。工業(yè)生產上要求吸附樹脂不僅具有吸附容量大的特點，而且要求其解吸率高，可最大限度地提高目標產物的回收率。EGC屬非酯型兒茶素，是低苦澀味兒茶素的主要成分，而EGCG屬酯型兒茶素，為苦澀味兒茶素的主要成分，兒茶素組分中EGC/EGCG的比值越高，表示該樹脂富集低苦澀味兒茶素能力越強。試驗中按照1.5所述的方法，在相同實驗條件下，測得9種不同樹脂的靜態(tài)吸附及脫附結果(見表1)。

表1 9種樹脂對不同兒茶素組分及咖啡因的吸附與脫附結果

結果表明，ADS-17樹脂所吸附的兒茶素中EGC/EGCG比值為0.44，且脫附回收率達89.3%，是一種比較理想的目標樹脂，其對咖啡因及兒茶素成分的飽和吸附量為90.7 mg/g。

2.2 茶多酚濃度對樹脂吸附性能的影響

對篩選出的ADS-17樹脂，考察其在不同茶多酚質量濃度下的吸附量與吸附率，數(shù)據(jù)見表2與圖1。結果表明，隨著茶多酚濃度的增加，樹脂的吸附量基本保持不變，但吸附率卻明顯下降，茶多酚質量濃度為30 g/L時的吸附率較10 g/L的相應值下降了近50%。為此，要保證目標產物的有效回收，則進行吸附操作時其質量濃度不宜過高。

表2 茶多酚濃度對樹脂吸附性能的影響

圖1 茶多酚濃度對脂吸附性能的影響

2.3 吸附時間對吸附量的影響

ADS-17樹脂在室溫下的吸附量隨時間的變化見表3，其動力學吸附過程曲線見圖2。結果表明，ADS-17樹脂的吸附量隨時間的延長而增大，在前60 min的增加速度很快，在120 min時達到最大吸附量的94.5%，隨后吸附量趨于穩(wěn)定，較佳的吸附時間宜選120 min。

表3 吸附時間對吸附量的影響

2.4 樹脂的動態(tài)吸附結果

考察ADS-17樹脂的動態(tài)吸附能力，得到動態(tài)吸附曲線，確認穿透點。按1.5實驗條件所得結果見表4及圖3。穿透點的確認:當流出液中EGC濃度達到起始濃度的10%時即認為達到穿透點。為保證目標成分的回收率，到達該點時應當終止吸附。實驗結果表明，在所述的實驗條件下，當流出液體積達7 BV時，EGC的濃度顯著增大，很快達到穿透點。因而，在實際操作中應注意控制吸附體積，以5～6 BV/批為宜。

圖2 吸附時間對吸附量的影響

表4 動態(tài)吸附結果

圖3 動態(tài)吸附曲線

2.5 動態(tài)脫附實驗

對飽和吸附的ADS-17樹脂用重蒸水洗去水溶性雜質，至流出液澄清后進行乙醇濃度梯度脫附，考察咖啡因及兒茶素組分在各個濃度梯度脫附液中的分布情況，結果見表5。實驗表明，咖啡因基本分布在10%的乙醇脫附溶液中，30%乙醇能脫附EGC，乙醇濃度達50%以上才能對EGCG有效脫附，由此可推出吸附樹脂吸附操作完成之后，先水洗去雜，然后以10%乙醇脫咖啡因，再以30%乙醇脫附EGC，可制得低咖啡因和低EGCG含量的低苦澀味兒茶素。

表5 乙醇溶液梯度洗脫結果 %

2.6 工藝驗證

取質量濃度為30 g/L的茶多酚溶液2 500 mL上ADS-17大孔吸附樹脂柱，依次用3 BV重蒸水洗，3 BV體積分數(shù)10%乙醇洗與3 BV體積分數(shù)30%乙醇洗，收集30%乙醇洗脫液，減壓濃縮、真空干燥，所得兒茶素中咖啡因、EGC、EGCG及兒茶素的總量分別為1.08%、43.84%、10.39%和67.9%，其中EGC占兒茶素總量的64.57%，是主要的呈味物質，與兒茶素的天然組成相比，非酯型兒茶素比例大幅提高，苦澀味降低。

3 結論

利用ADS-17大孔吸附樹脂實現(xiàn)富集以EGC為代表的低苦澀味兒茶素是完全可行的。本論文提出的新工藝僅采用水和食用乙醇作溶劑，可完全替代傳統(tǒng)的三氯甲烷脫咖啡因、乙酸乙酯萃取兒茶素的工藝路線，所得產品中無有害溶劑殘留，生產過程綠色、環(huán)保，且制備工藝簡單，非常適宜于工業(yè)化推廣。

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