張耀祺，王彬，師寶忠，閆鶴，石磊

1(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州，510640) 2(保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北保定，071000)3(河北省生物工程技術(shù)研究中心，河北保定，071002)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，屬于李斯特菌屬(Listeria)，為細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽(yáng)性桿菌。單增李斯特菌是重要的人獸共患病病原體，也是食品中常見的，公共衛(wèi)生學(xué)上重要的食源性病原體［1］。WHO和FDA于1986年設(shè)立了李斯特菌研究中心，專門協(xié)調(diào)該菌的病原學(xué)、流行病學(xué)及臨床等研究工作。該菌已被列為20世紀(jì)90年代四大食源性疾病致病菌之一［2］。

單增李斯特菌廣泛分布在自然環(huán)境中，如土壤、污水、飼料、動(dòng)物、健康人攜帶者及各種生食和即食食品中包括生肉及熟肉制品、速凍米面食品、奶酪、蔬菜、沙拉和海產(chǎn)品等［3］。近十幾年來(lái)世界各地，特別是美國(guó)、法國(guó)、英國(guó)、西班牙和日本等發(fā)達(dá)國(guó)家，因單增李斯特菌污染食品而引起食源性疾病爆發(fā)日益增多，該菌致病性強(qiáng)、致死率高達(dá)30%［4－5］。我國(guó)到目前為止，雖未出現(xiàn)有關(guān)單增李斯特菌引起食物中毒爆發(fā)流行的報(bào)道，但從國(guó)內(nèi)多篇調(diào)查報(bào)道了解，單增李斯特菌多年來(lái)在我國(guó)豬、羊、雞、牛、兔等家禽家畜中有流行［6－7］，并已經(jīng)報(bào)告的臨床散發(fā)病例有數(shù)十例［8］。目前食品中由單增李斯特菌引起的中毒已引起世界各國(guó)的重視。

血清分型法雖已被用于單增李斯特菌的流行病學(xué)調(diào)查和群體遺傳學(xué)研究，但是與分子分型方法相比，重復(fù)性差且分辨力不高，一般作為分型的輔助方法［9］。脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型(Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)具有分型能力強(qiáng)、分辨力高、重復(fù)性好、結(jié)果易于解釋等優(yōu)點(diǎn)，是目前分子分型方法的黃金標(biāo)準(zhǔn)。20世紀(jì)80年代末90年代初，PFGE開始被用于單增李斯特菌的分型研究［10］。單增李斯特菌的血清分型和脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型促進(jìn)了對(duì)李斯特菌病暴發(fā)的監(jiān)控和單增李斯特菌污染源的追蹤，該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究為李斯特菌病的有效預(yù)防與控制奠定重要基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌株

53株單增李斯特菌分離自2005年～2007年中國(guó)河北省的各種生肉類食品，見表1。

1.2 儀器與試劑

Smart Spec Plus型分光光度計(jì)，Bio-Rad公司;CHEF MAPPER型脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀及配套設(shè)備，Bio-Rad公司;凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司。

腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基(BHI)，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;單增李斯特菌分型血清，日本デンカ生研株式會(huì)社;低熔點(diǎn)瓊脂糖、電泳級(jí)瓊脂糖，Bio-Rad公司;溶菌酶、蛋白酶K，Sigma公司;限制性內(nèi)切酶ApaⅠ，CHIMERx公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)，北京普博欣生物科技有限公司;細(xì)胞裂解液(CLB);1×TE緩沖液;0.5×TBE電泳緩沖液。

表1 單增李斯特菌菌株來(lái)源

2 方法

2.1 血清分型實(shí)驗(yàn)

參照單增李斯特菌診斷血清使用說(shuō)明書，O抗原采用玻片凝集法，H抗原采用試管凝集法。

2.2 PFGE 分型實(shí)驗(yàn)

從凍存管中挑細(xì)菌接種于BHI培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取2 mL菌液于離心管中，高速離心沉淀細(xì)菌，用TE緩沖液洗滌3次。加入適量TE緩沖液重新懸浮細(xì)菌，將懸液OD600nm的吸光度調(diào)整在1.25 ～1.35之間［11］。取 300 μL 菌液加入工作濃度為20 mg/mL的溶菌酶，混合均勻，37℃溫育30 min。加入等體積SSP消化液(1%SDS，1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖，0.2 mg/mL蛋白酶K，50℃)混勻后倒入模具制備膠塊。將完全凝固的膠栓轉(zhuǎn)入含有2 mL細(xì)胞裂液的離心管中，54℃振搖孵育2 h。用54℃預(yù)熱的雙蒸水洗滌膠栓2次，每次浸泡10 min。用54℃預(yù)熱的TE緩沖液洗滌膠栓4次，每次浸泡15 min。最后每管加入5 mL pH值8.0的TE緩沖液。然后切膠至1.5 mL PE管中，加入300 μL酶切反應(yīng)體系(其中含ApaⅠ酶200U)，于37℃酶切反應(yīng)過(guò)夜［12］。消化后的樣品栓置于1.2%的凝膠加樣孔中進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳。電泳條件:電泳溫度14℃，電壓6 V，脈沖角度120°，脈沖時(shí)間4～40 s，電泳時(shí)間 22 h［13］。電泳結(jié)束后，將凝膠用1 μg/mL的EB溶液染色30 min，在凝膠成像系統(tǒng)讀膠。用Quantity One軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。

3 結(jié)果

3.1 血清分型實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究分別對(duì)53株單增李斯特菌進(jìn)行血清學(xué)分型，結(jié)果分屬5個(gè)血清型。其中 29株為1/2a(54.72%)，11 株為 1/2b(20.75%)，10 株為 1/2c(18.87%)，2 株為 4b(3.77%)，1 株為 4c(1.89%)1/2a，1/2b和1/2c屬于主要血清型。各菌株對(duì)應(yīng)的血清型詳見圖1。

3.2 PFGE圖譜聚類分析結(jié)果

本研究對(duì)53株單增李斯特菌進(jìn)行了PFGE分型，基因組DNA用ApaⅠ酶切后，經(jīng)電泳DNA片段得到良好的分離，53株均產(chǎn)生清晰的條帶，各株細(xì)菌DNA條帶數(shù)目為10～13條。所有單增李斯特菌菌株的PFGE圖譜結(jié)果用Quantity One軟件進(jìn)行分析，其相似值在52% ～100%。PFGE圖譜詳見圖1。

Tenover等［14］提出了有關(guān)菌株同源性的判別標(biāo)準(zhǔn)，按其電泳條帶可分為:無(wú)差異，說(shuō)明為相同菌株;有1～3條帶的差異說(shuō)明菌株間有相近關(guān)系，且只有單基因的改變;4～6條帶的差異說(shuō)明菌株間可能有相近關(guān)系，表示出有2個(gè)獨(dú)立基因的差異;如菌株間有6條帶或更多條帶差異，說(shuō)明有3個(gè)或更多基因的變化，被視為無(wú)相關(guān)性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可把53株單增李斯特菌分成17個(gè)基因型(A-Q)。主要型別為Q型(12株)，占總數(shù)的22.64%(12/53)，提示該型為河北省生肉類食品主要基因型。其余依次降低的型別為P型15.09%(8/53)，L型13.21%(7/53)，J型11.32%(6/53)?；蚍中徒Y(jié)果詳見圖1。

4 討論

血清分型是一種傳統(tǒng)的細(xì)菌分型方法。根據(jù)菌體O抗原和鞭毛H抗原，可將單增李斯特菌分為16個(gè)血清型:1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b 和 7。抗原結(jié)構(gòu)與毒力無(wú)關(guān)，對(duì)人致病的主要為血清型為4b，其次是1/2a和1/2b，3者約占本病的90%［15］，其中大多數(shù)經(jīng)由食物污染引起的李斯特菌病屬于4b血清型［16］。本次從食品中分離得到的53株單增李斯特菌的血清型主要為1/2a(54.72%)，1/2b(20.75%)和 1/2c(18.87%)，4b血清型卻相對(duì)較少，這與國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道一致［17－18］。這幾種血清型均有較強(qiáng)的致病性，能引起嚴(yán)重的李斯特菌食源性疾病，危害身體健康。因此，應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)食品中單增李斯特菌的監(jiān)測(cè)力度，重點(diǎn)防治由上述幾種血清型菌株引起的食物中毒。

圖1 LM菌株的PFGE聚類樹狀圖

PFGE如今已經(jīng)廣泛用于單增李斯特菌的分子流行病學(xué)和溯源性追蹤研究，并被認(rèn)為是目前所有分型方法中最為可靠的一種。從本次研究菌株的PFGE聚類分析圖譜來(lái)看，53株單增李斯特菌分成17個(gè)基因型(A-Q)，其中Q型為河北省流行的主要基因型，占總數(shù)22.64%。17個(gè)基因型之間出現(xiàn)了4條以上的差異條帶，說(shuō)明這些菌株的基因型不緊密相關(guān)。雖然有一部分菌株之間遺傳學(xué)表現(xiàn)形式相同，但是大部分菌株在遺傳學(xué)上有不同的表現(xiàn)形式，即菌株之間的相關(guān)性不大，證明各類食品中的單增李斯特菌的污染是來(lái)自多方面的，多個(gè)克隆株的。

綜合血清分型和PFGE分型結(jié)果進(jìn)行分析，在4種主要的PFGE基因型中，Q型(22.64%)包括了血清型1/2a和1/2c;P型(15.09%)包括血清型1/2a、4c;L型(13.21%)和J型(11.32%)都只含血清型1/2a。對(duì)人致病的最主要血清型4b有兩株，都分布于H基因型(見圖1)。血清型和PFGE 2種分型方法各具特色，相互不能替代，兩者從不同側(cè)面反映單增李斯特菌的分型特點(diǎn)。結(jié)合兩種分型方法能更好地了解單增李斯特菌各菌株之間的遺傳相關(guān)性及流行病學(xué)特征，促進(jìn)了對(duì)李斯特菌病暴發(fā)的監(jiān)控和單增李斯特菌污染源的追蹤。

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