劉艷豐，黃惠華

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640)

茶葉中含有生物堿、茶多酚等生物活性成分，因而茶葉具有抗氧化、抗菌、減肥、降血脂、降血糖、防止動(dòng)脈硬化和血栓形成等多種保健功能［1］。對(duì)各種疾病的具體影響機(jī)理尚不明確。淀粉在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)化是食物消化的重要部分，淀粉酶抑制劑能有效抑制唾液和胰α-淀粉酶活性，阻礙食物中碳水化合物的分解和消化，減少葡萄糖產(chǎn)生和攝取，降低人體血糖水平，減少糖類(lèi)向脂肪的轉(zhuǎn)化，有效預(yù)防和改善糖尿病以及肥胖癥等疾?。?］。茶多酚是茶中最重要的功能活性物質(zhì)，20世紀(jì)90年代，日本學(xué)者在體外模擬淀粉消化試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兒茶素可以抑制大鼠體內(nèi)α-淀粉酶和蔗糖酶的活性［3］。另外，張冬英等的研究也表明，普洱茶茶液中的沒(méi)食子酸對(duì)α-淀粉酶有較強(qiáng)的抑制作用，且普洱茶對(duì)α-淀粉酶的抑制效果隨著茶葉貯存年代與產(chǎn)地的不同而各異［4－5］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)茶多酚在體外對(duì)α-淀粉酶作用機(jī)理研究以及發(fā)酵程度不同的茶對(duì)淀粉酶的抑制作用研究比較缺乏。

本實(shí)驗(yàn)以鐵觀音與黑茶六堡茶的茶提取液為α-淀粉酶抑制劑，以茶浸提液中的固形物含量為表征，通過(guò)非連續(xù)測(cè)定和Dixon作圖分析，探求這2種發(fā)酵程度不同茶的茶液對(duì)胰α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵觀音，福建省安溪縣豐發(fā)茶廠;六堡茶，廣西蒼梧六堡茶葉有限公司;茶多酚，購(gòu)于福建市場(chǎng);豬胰α-淀粉酶(porcine pancreas amylase，PPA)，Sigma 公司;可溶性淀粉和麥芽糖等，均為分析純。DNS(3，5-二硝基水楊酸)顯色劑溶液。

pHS22C型pH計(jì)，上海雷磁儀器廠;棱光752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋，浙江臨海市東方儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶溶液的制備

稱(chēng)取磨碎的2種茶的茶樣各10 g，80 mL水，80℃水浴提取25 min，重復(fù)3次，然后4 000 r/min離心20 min，取上清液過(guò)濾后加水定容至250 mL。

1.2.2 茶浸提液中固形物與茶多酚含量測(cè)定

固形物含量測(cè)定:準(zhǔn)確量取按1.2.1方法獲得的茶液50 mL到已知重量的燒杯中，經(jīng)真空冷凍干燥后稱(chēng)重，經(jīng)計(jì)算，得出茶浸提液中的可溶性固形物總含量。

茶多酚含量測(cè)定:福林法［6］。以茶多酚含量表征茶液中的抑制劑含量。

1.2.3 酶活性的測(cè)定

采用Bernfeld法測(cè)定［7］。酶活性定義:在pH值為7，37℃的條件下，1 min內(nèi)生成1 μmoL還原糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。測(cè)定酶的活性時(shí)，移取0.5 mL胰α-淀粉酶溶液到15 mL試管，37℃恒溫，然后加入37℃預(yù)熱的0.5 mL濃度為1%淀粉溶液作為反應(yīng)底物，37℃反應(yīng)3 min，加入l mL DNS顯色溶液，混合，沸水浴8 min，放置20 min使其冷卻至室溫，加蒸餾水10 mL稀釋?zhuān)?40 nm處測(cè)定吸光值。以0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液作為空白對(duì)照。

1.2.4 兩種茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶半抑制濃度的確定

取0.25 mL濃度為0.08 mg/mL的酶液于試管，分別加入0.25 mL稀釋不同倍數(shù)后的茶浸提液，混合均勻并置于37℃水浴中預(yù)熱。10 min后加入0.5 mL

式中，T1和T2分別代表無(wú)抑制劑和有抑制劑時(shí)的酶活力。

1.2.5 兩種茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶的抑制類(lèi)型

1.2.5.1 抑制類(lèi)型(可逆或不可逆)的研究

固定2種茶浸提液的稀釋倍數(shù)均為6倍，分別在酶濃度為 0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL的條件下，按照1.2.3所示方法測(cè)定吸光值，作為加抑制劑的反應(yīng)組。再以蒸餾水代替2種茶液，作為不添加抑制劑的反應(yīng)組，以上述各酶濃度進(jìn)行反應(yīng)，同樣按1.2.3所示方法測(cè)定吸光值，作為未加入抑制劑的反應(yīng)組，2組都以緩沖液代替酶液，蒸餾水代替茶液在同樣的條件下反應(yīng)作為空白對(duì)照。根據(jù)酶活性的變化與浸提液濃度之間的關(guān)系判斷抑制類(lèi)型。

1.2.5.2 可逆性抑制類(lèi)型的研究

固定酶濃度為0.06 mg/mL，底物淀粉溶液的濃度在0.5%和1%之間變化，加入稀釋倍數(shù)分別為4倍，6倍，8倍、10倍的2種茶浸提液，按照1.2.3所示方法測(cè)定反應(yīng)吸光度值，然后通過(guò)dixon作圖，得到2條直線，根據(jù)獲得的dixon圖判斷2種茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶的抑制類(lèi)型并計(jì)算其抑制常數(shù)Ki。

1.2.6 兩種茶液對(duì)胰α-淀粉酶的光譜性質(zhì)影響

移取3 mL濃度為0.06 mg/mL的胰α-淀粉酶溶液于石英比色池中，掃描200～300 nm的吸收光譜后，用微量進(jìn)樣器加入不同體積的同樣稀釋10倍的2種茶提液到含有酶液的比色池中，混勻，放置3～5 min后再次掃描200～300 nm的吸收光譜。移取2 mL濃度分別從0.5 mg/mL至1 mg/mL茶多酚溶液于石英比色池中，掃描200～300 nm的吸收光譜，獲得2種茶液各自在不同濃度下作用于胰α-淀粉酶溶液的紫外吸收差譜。預(yù)熱到37℃的1%淀粉溶液。反應(yīng)3 min立即加1.0 mL DNS顯色劑，混合，沸水浴8 min，冷卻后用10 mL蒸餾水稀釋?zhuān)?40 nm處測(cè)定吸光值。另取0.25 mL緩沖溶液替代酶溶液作空白對(duì)照，以0.25 mL蒸餾水代替茶提液作無(wú)抑制劑的酶活測(cè)定，求出抑制效率，進(jìn)行多元非線性擬合，得回歸方程，求出半抑制濃度。抑制活性計(jì)算公式為［8］:

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種茶浸提液中的固形物與茶多酚含量及對(duì)胰α-淀粉酶半抑制濃度

250 mL的鐵觀音與六堡茶茶浸提液中的可溶性固形物含量分別為3.25 g與2.56 g，總茶多酚含量分別為1.17 g與0.74 g，鐵觀音與六堡茶茶液中茶多酚濃度分別為4.69 mg/mL與2.95 mg/mL，即鐵觀音中的茶多酚含量明顯高于六堡茶，這可能與六堡茶的發(fā)酵程度比鐵觀音的發(fā)酵程度高有關(guān)，因?yàn)椴瓒喾釉诓璧陌l(fā)酵過(guò)程中會(huì)不斷轉(zhuǎn)化成茶黃素、茶紅素等物質(zhì)，且發(fā)酵程度越高，茶多酚減少量越大［9］。

圖1 鐵觀音茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶的抑制曲線

圖2 六堡茶茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶的抑制曲線

圖1 與圖2所示分別為2種茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶的抑制效果曲線。在EXCLE中進(jìn)行多元非線性擬合，得鐵觀音茶茶浸提液抑制曲線回歸方程為:y=－0.007 1x4+0.100 4 x3－0.461 1 x2+0.883 8 x－0.228 7，R2=0.999 7，六堡茶茶浸提液抑制曲線回歸方程為:y=0.000 8x3+0.007 5x2－0.010 6x+0.123 6，R2=0.998 9，2 種茶對(duì)胰 α-淀粉酶的半抑制濃度分別為茶浸提液中的固形物濃度為2.88 mg/mL和10.48 mg/mL。

2.2 兩種茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶的抑制類(lèi)型

鐵觀音與六堡茶茶液對(duì)胰α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線如圖3、圖4所示。根據(jù)抑制劑與酶的作用方式與特點(diǎn)，抑制作用分為可逆抑制與不可逆抑制作用兩種。不可逆抑制作用是通過(guò)抑制劑與酶的作用，通過(guò)價(jià)鍵結(jié)合的方式引起酶的失活，又被稱(chēng)為酶的修飾抑制，可逆抑制作用的抑制劑與酶通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合，去除抑制劑后酶的活性可以恢回復(fù)。當(dāng)反應(yīng)體系中有可逆性抑制劑存在時(shí)，得到的直線為通過(guò)原點(diǎn)，但斜率小于不加入抑制劑組的直線斜率，當(dāng)體系中存在不可逆抑制劑時(shí)，得到的直線不通過(guò)原點(diǎn)［10］。因此，由圖3、圖4可推斷鐵觀音與六堡茶茶液對(duì)豬胰α-淀粉酶的抑制類(lèi)型都為可逆抑制作用。

圖3 鐵觀音茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線

圖4 六堡茶茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線

2.3 兩種茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶的可逆抑制類(lèi)型

可逆抑制作用根據(jù)可逆抑制劑與底物的關(guān)系分為競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制3種類(lèi)型。當(dāng)dixon圖中的直線交點(diǎn)位于橫坐標(biāo)軸上時(shí)，非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制，若直線都與橫坐標(biāo)軸相交但交點(diǎn)不在橫坐標(biāo)軸上時(shí)，為競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制，若有直線與橫坐標(biāo)軸平行，且交點(diǎn)不在橫坐標(biāo)軸上時(shí)為競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制。

因此，由圖5、圖6可推斷出鐵觀音與六堡茶茶液對(duì)豬胰α-淀粉酶的可逆性抑制類(lèi)型都為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。另由于dixon圖中各直線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)即為抑制劑常數(shù)，故計(jì)算得知鐵觀音與六堡茶茶液對(duì)胰α-淀粉酶的抑制常數(shù)分別為茶浸提液中固形物濃度為3.96 mg/mL與13.30 mg/mL。

2.4 兩種茶液與胰α-淀粉酶溶液作用的紫外光譜

圖5 鐵觀音茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶的可逆性抑制dixon圖

圖6 六堡茶茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶的可逆性抑制dixon圖

胰α-淀粉酶溶液在200～300 nm范圍內(nèi)具有212 nm處與259 nm處2個(gè)較大的吸收峰，由于212 nm處的波譜產(chǎn)生跳躍，影響比較結(jié)果，故選定245～275 nm作為考察范圍，研究加入不同固形物總量的兩種茶浸提液與胰α-淀粉酶溶液作用后的紫外吸收差譜，如圖7所示，圖中的曲線1為50 μL稀釋10倍的鐵觀音茶液(固形物總量為65 μg)與3 mL胰α-淀粉酶溶液的紫外光譜圖，曲線2為100 μL稀釋10倍的鐵觀音茶液(固形物總量為130 μg)與3 mL胰α-淀粉酶溶液的紫外光譜圖，曲線3為60 μL稀釋10倍后的六堡茶茶液(固形物總量為19.2 μg)與3 mL胰α-淀粉酶溶液作用的紫外吸收光譜圖，曲線4為80μL稀釋10倍后的六堡茶茶液(固形物總量為25.6 μg)與3 mL胰α-淀粉酶溶液作用的紫外吸收光譜圖。酶在近紫外光區(qū)域之的光吸收能力是由分子中的 Trp，Tyr，Phe 等殘基引起［11］，這些基團(tuán)的微環(huán)境改變引起基團(tuán)的結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步影響吸光性質(zhì)，如環(huán)境中劑型的改變會(huì)引起吸收峰的藍(lán)移或紅移。因此，從圖7可知，在259 nm處，鐵觀音與六堡茶茶浸提液與胰α-淀粉酶溶液作用后的紫外吸收強(qiáng)度隨著各自加入茶液的固形物含量增多而增強(qiáng)，即胰α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)變化越大。

3 結(jié)論

圖7 兩種茶浸提液與胰α-淀粉酶溶液作用的紫外吸收差示光譜

鐵觀音與六堡茶的茶液對(duì)豬胰α-淀粉酶都存在抑制作用，且抑制類(lèi)型都為非競(jìng)爭(zhēng)型可逆抑制 ，得鐵觀音茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶的半抑制濃度(IC50)為固形物濃度2.88 mg/mL，六堡茶茶浸提液對(duì)胰α-淀粉酶的半抑制濃度(IC50)為固形物濃度10.48 mg/mL，即鐵觀音對(duì)豬胰α-淀粉酶抑制作用明顯強(qiáng)于六堡茶，得鐵觀音茶浸提液的Ki值為固形物含量3.96 mg/mL，六堡茶茶浸提液的Ki值為固形物含量13.30 mg/mL。紫外吸收差譜結(jié)果表明，一定范圍內(nèi)，2種茶液濃度的增加，使經(jīng)茶液處理的α-淀粉酶溶液在259 nm處吸收峰增強(qiáng)，但不發(fā)生明顯紅移?？勺鳛椴煌贩N的茶對(duì)胰α-淀粉酶的機(jī)理分析和應(yīng)用評(píng)價(jià)。

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