彭士明, 施兆鴻, 陳 超, 侯俊利

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所, 上海 200090; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東青島 266071)

根據(jù)mtDNA D-loop序列分析東海銀鯧群體遺傳多樣性

彭士明1, 施兆鴻1, 陳 超2, 侯俊利1

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所, 上海 200090; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東青島 266071)

根據(jù)線粒體D-loop序列對舟山群島附近海域的銀鯧(Pampus argenteus)群體(n=24)的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。通過PCR技術(shù)對線粒體D-loop序列進(jìn)行擴(kuò)增, 獲得大小約為500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化并進(jìn)行序列測定后, 得到了357 bp的核苷酸片段。在24個個體中, 共檢測到14個變異位點(diǎn), 其中8個轉(zhuǎn)換位點(diǎn), 5個顛換位點(diǎn), 1個轉(zhuǎn)換與顛換同時存在的位點(diǎn)。運(yùn)用MEGA軟件計算出不同個體間的遺傳距離, 并根據(jù)其遺傳距離構(gòu)建了UPGMA和NJ系統(tǒng)樹。DNASP軟件計算出的單倍型多樣性(h)、核苷酸多樣性(π)及平均核苷酸差異數(shù)(k)分別為 0.89、0.007與 2.57。此外, 岐點(diǎn)分布及中性檢驗(yàn)顯示, 東海銀鯧群體在歷史上可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張。研究結(jié)果表明, 線粒體D-loop基因可用于銀鯧群體內(nèi)及群體間遺傳多樣性的分析。

銀鯧(Pampus argenteus); 東海; 線粒體DNA; D-loop序列

銀鯧(Pampus argenteus)是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類, 具有巨大的市場需求, 廣泛分布于東海、東南亞海、波斯灣、阿拉伯海和印度洋[1,2]。近年來, 由于過度捕撈其全球捕撈產(chǎn)量已顯著降低[3]。中國鯧屬魚類資源的狀況也并不容樂觀, 從最新的調(diào)查和日常監(jiān)測結(jié)果來看, 鯧魚資源受到了嚴(yán)重的破壞, 過度捕撈不僅嚴(yán)重影響了捕撈種類的群體數(shù)量, 而且改變了鯧魚的群體組成結(jié)構(gòu)[4]。以往有關(guān)東海銀鯧的研究主要集中在其漁業(yè)資源學(xué)[5,6]、繁殖生物學(xué)[7～10]及其人工育苗[11]等方面, 其遺傳多樣性方面的研究國內(nèi)尚未見有相關(guān)報道。

線粒體基因組(mtDNA)具有結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳、進(jìn)化速率快、幾乎不發(fā)生重組等特點(diǎn), 業(yè)已成為研究種內(nèi)、種間近緣群體間遺傳分化關(guān)系的有效工具之一[12]。本研究對東海區(qū)銀鯧線粒體 DNA控制區(qū)(D-loop)序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增和測序以分析東海區(qū)銀鯧群體的遺傳多樣性, 研究結(jié)果可為制定合理的資源增殖與保護(hù)措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

24尾銀鯧樣品采自舟山群島附近海域, 平均叉長為15.5 cm, 平均體質(zhì)量為114.3 g, 取背部肌肉組織, 置于 95%乙醇中保存, 存放于-20℃中保存待用。

1.2 DNA的提取、擴(kuò)增及測序

分別從24尾銀鯧樣品中取0.1 g肌肉用于提取總DNA。總DNA的提取采用常規(guī)的酚-氯仿方法[13],DNA經(jīng)沉淀、洗滌并干燥后, 溶于50 μL TE緩沖液中, 于-20℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

擴(kuò)增所用引物為, L15926：5′-TCAAAGCTTACACCAGTCTTGTAAACC-3′, H16498：5′-CCTGAAGTAGGAACCAGATG-3′[14]。每個 PCR反應(yīng)總體積為50 μL, 其中 29.6 μL 超純水、5 μL 10 × PCR 緩沖液、2 μL 10 mm dNTPs、5 μL 25 mm MgCl2、4 μL 10 mm引物(各 2 μL)、0.4 μL Taq DNA 聚合酶、4 μL 模板DNA。在GeneAmp PCR儀(9700)上進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min, 然后進(jìn)行35個循環(huán)(94℃ 45 s, 52℃ 1 min, 72℃ 1 min), 72℃延伸 7 min,10℃保溫。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離, EB染色, 凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后, 在全自動基因測序分析儀CEQ8000 (Beckman Coulter, US)上進(jìn)行測序, 測序所用引物為擴(kuò)增引物。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Clustal X[15]程序?qū)NA序列進(jìn)行多重對位排列并輔以手工校正。用 MEGA 4.0軟件[16]分析不同序列間的堿基組成、變異位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)等, 并計算個體間的遺傳距離, 構(gòu)建 UPGMA與 NJ系統(tǒng)樹。用DNASP4.0[17]計算單倍型多態(tài)性(h)和核苷酸多樣性(π)等遺傳多樣性指數(shù)。使用 Arlequin 3.0[18]進(jìn)行歧點(diǎn)分布分析(Mismatch distribution)[19]、Tajima檢驗(yàn)(Dtest)[20]和 Fu 檢驗(yàn)(Fsneutrality test)[21], 用以進(jìn)行種群歷史分析。

2 結(jié)果

2.1 D-loop片段的序列特征及其多態(tài)性

經(jīng)電泳檢測, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小約為 500 bp的1條整齊而清晰的條帶。本研究共測定了銀鯧24個個體的mtDNA D-loop序列片段, 在除去引物及部分端部序列后, 經(jīng) BLAST對比, 獲得銀鯧線粒體D-loop序列5′端的長度為357 bp的片段。

A、T、C、G 4種堿基在24個個體中的平均比例分別為 40.1%、30.6%、16.7%、12.6%, AT比例(70.7%)高于 GC(29.3%), 符合脊椎動物 mtDNA D-loop區(qū)域堿基組成的特點(diǎn)。D-loop序列變異位點(diǎn)在銀鯧群體中的分布如表1所示。357 bp長度的核苷酸序列中共檢測到 14個變異位點(diǎn), 其中 8個轉(zhuǎn)換位點(diǎn), 5個顛換位點(diǎn), 1個轉(zhuǎn)換與顛換同時存在的位點(diǎn)。

表1 變異位點(diǎn)在24條銀鯧D-loop序列中的分布Tab. 1 Distribution of variable sites in 24 individuals of silver pomfret

2.2 群體的遺傳多樣性及其個體間的遺傳關(guān)系

通過DNASP 4.0軟件計算出這24個個體的遺傳多樣性參數(shù)為：多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(S)為14, 單倍型個數(shù)(H)為 11, 單倍型多樣性(h)為 0.89, 核苷酸多樣性(π)為0.007, 平均核苷酸差異數(shù)(k)為2.57。由此可以看出,該群體銀鯧具有較高的單倍型多樣性, 但核苷酸多樣性較低。

應(yīng)用MEGA 4.0軟件, 根據(jù)線粒體D-loop序列算出 24個個體間的 Kimura 2-parameter遺傳距離,個體間的遺傳距離在0.000～0.017之間, 其中遺傳距離達(dá)到0.017的共有8組, 而遺傳距離＞0.01的至少有80組。以24個個體的D-loop序列構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)樹和NJ系統(tǒng)樹分別如圖1、圖2所示。由圖1和圖2可以看出, 2種方法獲得的系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致, 24個個體均形成2大分支。

2.3 種群歷史分析

歧點(diǎn)分布分析表明(圖3), 歧點(diǎn)分布呈單峰狀,圖中曲線表示在突然擴(kuò)張假設(shè)理論下歧點(diǎn)分布的模擬值, 同時無限突變位點(diǎn)模型的中性檢驗(yàn)值Tajima’sD(-1.106,P= 0.138) 和Fs(-26.601,P= 0.000) 都是負(fù)值。結(jié)果提示東海銀鯧群體在歷史上可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張事件。

圖1 由D-loop序列得到的UPGMA系統(tǒng)樹Fig. 1 UPGMA phylogenetic tree based on D-loop sequences

圖2 由D-loop序列得到的NJ系統(tǒng)樹Fig. 2 NJ phylogenetic tree based on D-loop sequences

圖3 東海銀鯧線粒體DNA D-loop單倍型的歧點(diǎn)分布Fig. 3 Mismatch distribution based on control-region sequences of silver pomfret in the East China Sea

3 討論

通常序列分析(測序)是最為有效的揭示群體遺傳結(jié)構(gòu)的方法之一[22]。線粒體DNA (mtDNA)具有分子小而穩(wěn)定、母系遺傳、進(jìn)化速率快等特點(diǎn), 成為群體遺傳學(xué)的理想分子標(biāo)記[12]。控制區(qū)(D-loop區(qū))是mtDNA上的一段非編碼區(qū), 由于受選擇壓力小, 在進(jìn)化過程中積累了較多變異, 因而被認(rèn)為是線粒體基因組上進(jìn)化最快的部分之一。本研究測序分析了東海野生銀鯧群體線粒體D-loop區(qū)5′端的一部分片段, 以此研究分析東海銀鯧群體的遺傳多樣性。

本研究結(jié)果顯示, 東海銀鯧群體具有較高的單倍型多樣性(0.89)。已有的資料表明, 種群內(nèi)能夠維持較高單倍型多樣性的原因可能在于較大的種群數(shù)量、環(huán)境的不均一性或者具有適應(yīng)種群快速增長的生活特性[23]。對于海水魚類講, 較大的種群數(shù)量是維持較高遺傳多樣性的基礎(chǔ)[24]。銀鯧分布較廣, 間接說明其具有較大的種群數(shù)量, 此可能是其維持較高遺傳多樣性的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果還顯示, 東海銀鯧群體雖具有較高的單倍型多樣性, 但其核苷酸多樣性較低(0.007)。根據(jù)不同單倍型多樣性與核苷酸多樣性間的組合, 海水魚類大致可以分為4個類型：第一種類型是低的單倍型多樣性與低的核苷酸多樣性; 第二種類型是高的單倍型多樣性與低的核苷酸多樣性;第三種類型是低的單倍型多樣性與高的核苷酸多樣性; 第四種類型是高的單倍型多樣性與高的核苷酸多樣性[25]。本試驗(yàn)的結(jié)果為高的單倍型多樣性與低的核苷酸多樣性屬于第二種類型。已有的研究表明,鯨鯊(Rhincodon typus)(h= 0.90,π= 0.005)[26], 尖吻鯖鯊(Isurus oxyrinchus)(h= 0.76,π= 0.0035), 西北太平洋毛鱗魚(Mallotus villosus)、紅擬石首魚(Sciaenops ocellata)與西大西洋小沙丁魚(Sardinella aurita) (h= 0.79～0.98, π= 0.0029～0.0068)均屬于此種類型[25]。本研究中24個個體的D-loop序列所構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)樹和 NJ系統(tǒng)樹表明, 兩種方法所得到的系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致, 24個個體均形成兩大分支, 由于線粒體 DNA屬于母系遺傳, 由此可推斷該群體的24個個體可能來源于兩個不同的母系祖先。

通常有兩種方法檢驗(yàn)種群在歷史上是否發(fā)生過種群擴(kuò)張。一是采用Fu[21]的Fs中性檢驗(yàn)顯著偏離中性突變, 負(fù)的Fs值和差異顯著的P值被認(rèn)為種群在歷史上有擴(kuò)張的跡象。二是根據(jù)歧點(diǎn)分布曲線是否呈現(xiàn)多峰或單峰型。若核苷酸岐點(diǎn)分布曲線呈現(xiàn)單峰分布, 且中性檢驗(yàn)值顯著偏離中性, 則群體在過去可能經(jīng)受了種群擴(kuò)張[20]。本研究結(jié)果顯示, 歧點(diǎn)分布呈單峰狀, 且中性檢驗(yàn)值 Tajima’sD為-1.106(P= 0.138),Fs為–26.601 (P= 0.000), 表明東海銀鯧群體在歷史上可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張事件。

一個物種的遺傳多樣性高低與其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力密切相關(guān)。豐富的遺傳多樣性意味著比較高的適應(yīng)生存潛力, 蘊(yùn)藏著比較大的進(jìn)化潛能以及比較豐富的育種和遺傳改良的潛力, 而貧乏的遺傳多樣性則會給物種生存、進(jìn)化及種質(zhì)資源的保護(hù)和利用帶來許多不利影響[27]。本研究結(jié)果顯示, 東海銀鯧群體具有較高的單倍型多樣性(0.89),遺傳多樣性較為豐富。近年來, 由于過度捕撈, 導(dǎo)致魚體小型化、漁獲物低齡化, 嚴(yán)重?fù)p害幼魚資源, 造成產(chǎn)量不穩(wěn)定[4]。從長遠(yuǎn)角度看, 過度捕撈勢必破壞其遺傳多樣性和種質(zhì)資源的穩(wěn)定性。由于沒有之前的相關(guān)數(shù)據(jù), 本研究也無法判定東海銀鯧遺傳多樣性水平是否由于近年來的過度捕撈而有所降低, 同樣也無法確定東海銀鯧遺傳多樣性水平受其影響的程度。然而, 值得注意的是, 不能因?yàn)槟壳跋鄬ωS富的遺傳多樣性水平而忽視對銀鯧資源必要的保護(hù)與管理。目前應(yīng)針對中國范圍內(nèi)不同群體銀鯧資源的遺傳多樣性展開較為詳細(xì)的研究工作, 以期為今后的定期遺傳多樣性檢測奠定基礎(chǔ), 并根據(jù)其遺傳多樣性的變化趨勢采取相應(yīng)的保護(hù)措施, 科學(xué)的保護(hù)野生銀鯧的種質(zhì)資源, 使其資源能夠達(dá)到可持續(xù)利用, 此也有助于推動漁業(yè)產(chǎn)業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展。

本研究僅僅是針對舟山群島附近海域銀鯧資源遺傳多樣性的分析, 尚不能全面反映中國不同群體銀鯧的遺傳多樣性水平與群體分化狀態(tài)。今后應(yīng)運(yùn)用D-loop基因分析中國不同地區(qū)銀鯧群體的遺傳背景, 同時應(yīng)選擇 mtDNA其他不同的基因如Cytb、COⅠ等, 進(jìn)一步比較研究銀鯧群體內(nèi)及群體間的遺傳多樣性, 以全面揭示銀鯧資源的遺傳多樣性水平及其群體分化狀況, 以期能夠合理的開發(fā)利用我國的鯧魚資源。

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Genetic diversity analysis of silver pomfret (Pampus argenteus)in the East China Sea based on mtDNA D-loop sequence

PENG Shi-ming1, SHI Zhao-hong1, CHEN Chao2, HOU Jun-li1
(1.East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China;2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

Mar., 20, 2009

Pampus argenteus; East China Sea; mitochondrial DNA; D-loop sequence

Genetic diversity of silver pomfret (Pampus argenteus) in the East China Sea was investigated based on mtDNA D-loop sequences. The PCR technique was used to amplify the mtDNA D-loop in 24 individuals of silver pomfret collected from the East China Sea, near the coast waters of Zhoushan Islands. The PCR products were purified and sequenced. The results showed that 357bp nucleotide sequences of partial D-loop gene were obtained (the primer and some of the marginal sequences were excluded). Among the 24 individuals, 14 variation sites were observed, of which there were 8 transition sites, 5 transversion sites and 1 transition-transversion sites. The paiwise genetic distances were computed by MEGA software. The UPGMA and NJ phylogenetic trees were obtained through the cluster analysis over the pairwise genetic distance. The haplotype diversity (h), nucleotide diversity (π)and average number of pairwise nucleotide differences (k) were calculated by DNASP software, which were 0.89,0.007 and 2.57, respectively. Mismatch distribution analysis and Neutrality tests indicated a possible population expansion in silver pomfret population of the East China Sea. In conclusion, mtDNA D-loop may be one of the genetic markers available for scanning genetic diversity of intra-population and inter-populations of silver pomfret.

S968.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-3096(2010)02-0028-05

2009-03-20;

2009-07-03

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(東2008M14, 東2007Z02)

彭士明(1980-), 男, 山東東營人, 博士, 助理研究員, 研究方向：水生動物營養(yǎng)學(xué)與種質(zhì)資源學(xué), E-mail：shiming.peng@163.com;施兆鴻, 通信作者, E-mail：shizhh@sh163.net

康亦兼)