王慶輝,呂昌龍,施 鵬,劉 軍,龐 維,馮 輝,陳鯤鵬,單風(fēng)平＊

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,遼寧沈陽 110001;2.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬奉天醫(yī)院婦產(chǎn)科,遼寧沈陽 110024)

接觸性超敏反應(yīng)(Contact hypersensitivity,CHS)是由于接觸金屬、橡膠、化學(xué)制品、化妝品和藥物等外界物質(zhì)而引發(fā)的皮膚炎癥性改變,被認(rèn)為是由抗原特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。利用氯化苦咪酸(Trinitrochlorobenzene,TNCB)和二硝基氟苯(Dinitrofluorobenzene,DNF-B)等半抗原誘導(dǎo)CHS的小鼠模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,T細(xì)胞通過釋放TNF-α和IFN-γ等前炎癥性細(xì)胞因子,誘導(dǎo)局部組織細(xì)胞釋放趨化因子,募集白細(xì)胞至受侵部位,造成組織水腫、紅斑,反復(fù)刺激甚至可發(fā)生出血壞死。近年來,研究報道顯示I L-17也參與了CHS的致病過程。 IL-17主要是由Th17細(xì)胞分泌的一種前炎癥性細(xì)胞因子。Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt在CHS的表達(dá)增加[1]; IL-17-/-小鼠CHS的反應(yīng)和炎細(xì)胞的浸潤程度均低于野生對照小鼠[2];利用抗 IL-17抗體進(jìn)行體內(nèi)阻斷,也表明 IL-17在CHS的效應(yīng)階段發(fā)揮重要作用[3]。但抗原物質(zhì)如何誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生 IL-17尚未見報道。天然免疫的重要細(xì)胞—肥大細(xì)胞可釋放組胺、細(xì)胞因子等生物活性介質(zhì),阻止病原體的感染,構(gòu)筑了機(jī)體的第一道防線。據(jù)報道,肥大細(xì)胞通過釋放TNF-α等介質(zhì),募集中性粒細(xì)胞,參與CHS[4]。由于肥大細(xì)胞具有分泌多種細(xì)胞因子的能力,推測其可能具有誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌 IL-17的潛能,為此,本實(shí)驗(yàn)利用TNCB致敏C57BL/6小鼠,檢測肥大細(xì)胞體外誘導(dǎo)致敏淋巴細(xì)胞分泌 IL-17的能力,為進(jìn)一步揭示CHS的致病機(jī)制提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6小鼠(本校實(shí)驗(yàn)動物部提供),6～8周齡,雌性。

1.1.2 主要試劑 TNCB(Tokyo Kasei Co.,Tokyo,Japan);RPM I 1640培養(yǎng)基(Ther mo);FCS(Biological Industries,Haemek,Israel);小鼠 IL-3(PeproTech EC,London,United Kingdom);小鼠SCF(PeproTech EC);TNBS(Sigma);2.4G2(Pha rMingen);PE-anti FcεR I抗體(MAR-1,eBioscience),FITC-anti-c-kit抗體(BD Pharmingen);I L-6、TNF-α和 IL-17 EL ISA試劑盒(R&D Systems,Minneapolis,MN)。

1.1.3 主要儀器 FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,N.J.,USA);酶標(biāo)儀(Inte rMed NJ-2100);CO2孵箱(Harasawa,Japan)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓來源的肥大細(xì)胞(born marrow-derived mast cells,BMMC)的制備 C57BL/6小鼠,雌性,6～8周齡。無菌鈍性分離小鼠雙側(cè)股骨,用1 mL注射器吸取少量RPM I-1640培養(yǎng)液沖洗股骨骨髓內(nèi)細(xì)胞至10 cm無菌平皿中。收集細(xì)胞至10 mL離心管中,1 000 r/min,4℃離心5 min,棄上清。用10 mL BMMC培養(yǎng)液(含100 U/mL小鼠 IL-3和0.5 U/mL小鼠SCF的10%FCS-RPM I1640培養(yǎng)液)重懸細(xì)胞,移至10 cm無菌培養(yǎng)皿,于37℃,5%CO2孵箱孵育。常規(guī)換液,培養(yǎng)4周后待用。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測 收集BMMC,調(diào)細(xì)胞懸液濃度至5×106個/mL。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體2.42G的流式細(xì)胞儀專用染色管中加入細(xì)胞懸液0.1 mL,再加入PE-anti FcεR I單克隆抗體和FITC-anti-c-kit單克隆抗體,4℃避光孵育1 h后,加入1 mL PBS,1 000 r/min,4℃離心5 min,棄上清,洗細(xì)胞2遍。加入0.4 mL PBS混勻細(xì)胞。用FACSCalibur流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面FcεR I和c-kit表達(dá),即利用FACS CELLQUEST軟件獲取細(xì)胞,每個樣品分析10 000個細(xì)胞,使用前向散射角(FSC)及側(cè)向散射角(SSC)確定目的細(xì)胞群,然后以二維點(diǎn)陣圖顯示FcεR I+c-kit+的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.2.3 BMMC體外活化 收集BMMC,調(diào)BMMC細(xì)胞懸液濃度至1×106個/mL,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,0.2 mL/孔,再加入LPS(終濃度為1μg/mL),同時設(shè)只加培養(yǎng)液的陰性對照,于37℃,5%CO2孵箱孵育3 h(TNF-α)或6 h( IL-6)。收集培養(yǎng)上清,-20℃保存,待細(xì)胞因子檢測。

1.2.4 體外細(xì)胞共同培養(yǎng) 用溶于丙酮的100 μL 5%TNCB在去毛的C57BL/6小鼠腹部涂抹致敏,同時設(shè)未經(jīng)致敏的正常對照組。4 d后頸椎脫位處死小鼠,常規(guī)無菌分離腹部淋巴結(jié),制備淋巴細(xì)胞懸液,用10%FCS-RPM I 1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞懸液濃度至1×106個/mL。同時,無菌取正常小鼠脾臟,常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液,經(jīng)100μg/mL絲裂霉素C于37℃,5%CO2孵箱孵育30 min后,再經(jīng)溶于PBS的10 mmol/L TNBS于37℃孵育10 min,PBS洗細(xì)胞2遍,用10%FCS-RPM I 1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞懸液濃度至2×106個/mL,作為抗原提呈細(xì)胞(APC)。另將LPS活化的BMMC經(jīng)絲裂霉素C于37℃孵育30 min后,PBS洗細(xì)胞2遍,調(diào)細(xì)胞濃度至2×106個/mL(MC)。將TNCB致敏小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞(TNCB-LN)和未經(jīng)致敏的正常小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞(N-LN)分別與APC和MC以細(xì)胞數(shù)1：1：1比例接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,37℃,5%CO2孵箱孵育共同培養(yǎng),即分別為TNCB-LN+APC+MC實(shí)驗(yàn)組和N-LN+APC+MC對照組,同時設(shè)單純培養(yǎng)的TNCB-LN和NLN對照組。培養(yǎng)72 h后收集培養(yǎng)上清,-20℃保存,待 IL-17分泌檢測。

1.2.5 EL ISA試劑盒檢測細(xì)胞因子 按照EL ISA試劑盒說明書操作步驟分別檢測培養(yǎng)上清中TNF-α、 IL-6和 IL-17的分泌水平,每份標(biāo)本設(shè)3個復(fù)孔。用酶標(biāo)儀測定樣本的OD450值。以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,應(yīng)用Sof tMax Pro 4.3.1LS軟件分析,計算細(xì)胞因子含量(pg/mL)。

2 結(jié) 果

2.1 成熟BMMC表型鑒定

小鼠BMMC培養(yǎng)4周后,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,＞95%的細(xì)胞表達(dá)成熟肥大細(xì)胞的特異性表型(FcεR I+/c-kit+)(見圖1)。

圖1 BMMC特異性表面分子的表達(dá)Fig.1 The expressions of specific markers on BMMC

2.2 成熟BMMC經(jīng)LPS刺激后細(xì)胞因子的分泌

如圖2和圖3所示,小鼠BMMC培養(yǎng)4周后,培養(yǎng)上清中TNF-α和 IL-6的分泌處于較低水平,經(jīng)1μg/mL LPS孵育后,TNF-α(3 h)和 IL-6(6 h)的分泌水平分別高達(dá)(152.3±4.19)pg/mL和(1 285.5±446.5)pg/mL,提示LPS活化的BMMC具有分泌炎癥性細(xì)胞因子的能力。

圖2 BMMC經(jīng)LPS刺激后TNF-α的分泌水平Fig.2 The level of TNF-αin the supernatant of LPS incubated BMMC

圖3 BMMC經(jīng)LPS刺激后I L-6的分泌水平Fig.3 The level of IL-6 in the supernatant of

2.3 活化的BMMC誘導(dǎo)TNCB致敏小鼠淋巴細(xì)胞I L-17的分泌

如圖4所示,未致敏的淋巴細(xì)胞(N-LN)和TNCB致敏的淋巴細(xì)胞(TNCB-LN)單純培養(yǎng)后,

IL-17的分泌水平均較低;在TNBS處理的脾細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞和活化的BMMC的存在下,TNCB致敏的淋巴細(xì)胞 IL-17的分泌水平(TNCBLN+APC+MC組)顯著高于未致敏的淋巴細(xì)胞(N-LN+APC+MC組)。由此提示,肥大細(xì)胞可促進(jìn)TNCB致敏淋巴細(xì)胞的 IL-17分泌。

圖4 細(xì)胞混合培養(yǎng)上清中I L-17的分泌水平Fig.4 The level of IL-17 in the co-cultured supernatant

3 討 論

IL-17是介導(dǎo)Th17細(xì)胞發(fā)揮致炎效應(yīng)的關(guān)鍵性細(xì)胞因子[5],動員并活化炎癥部位的中性粒細(xì)胞[6],參與過敏性炎癥、自身免疫病、器官移植及腫瘤等疾病的發(fā)生[7-8]。近年來,研究結(jié)果顯示IL-17和Th17細(xì)胞也參與了CHS的免疫病理過程[1-3]。因此,探討影響 IL-17分泌的相關(guān)因素對CHS的防治具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)主要利用CHS的誘導(dǎo)劑TNCB致敏C57BL/6小鼠,旨在研究肥大細(xì)胞誘導(dǎo)TNCB致敏淋巴結(jié)細(xì)胞分泌 IL-17的能力。

肥大細(xì)胞主要位于黏膜和結(jié)締組織中,由于其數(shù)量少,不易分離、純化,研究者們通常用成熟的骨髓來源的肥大細(xì)胞(BMMC)進(jìn)行體外肥大細(xì)胞功能的研究。本實(shí)驗(yàn)中小鼠骨髓細(xì)胞在肥大細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)4周之后,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測＞95%的細(xì)胞表面表達(dá)肥大細(xì)胞特異性標(biāo)志FcεR I和c-kit,提示BMMC培養(yǎng)成熟。進(jìn)而,非特異性活化的BMMC可以分泌多種細(xì)胞因子,如TNF-α、IL-6和 IL-12/23p40等[9]。其中 IL-6和 IL-23是維持促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素[10];TNF也被報道可以促進(jìn)Th17細(xì)胞依賴性的中性粒細(xì)胞的募集[11]。因此,我們推測活化的BMMC可能具有誘導(dǎo)TNCB致敏淋巴細(xì)胞分泌 IL-17的能力。將小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞與TNBS體外孵育后的脾細(xì)胞和活化的BMMC共同培養(yǎng)后,結(jié)果顯示與未致敏的淋巴細(xì)胞對照組相比,BMMC能夠刺激TNCB致敏小鼠淋巴細(xì)胞 IL-17的分泌。由此提示在CHS的致敏階段,肥大細(xì)胞可能通過釋放IL-6、TNFα-等生物活性介質(zhì),促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化和 IL-17的分泌。肥大細(xì)胞在 IL-17依賴的CHS的作用還有待體內(nèi)試驗(yàn)的進(jìn)一步研究。

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