黃現(xiàn)青,高曉平,趙改名,史 超,李苗云,柳艷霞,張秋會(huì),孫靈霞

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河南鄭州 450002)

大腸埃希菌(Escherichia coli)廣泛分布于自然界,主要寄居于人及動(dòng)物的腸道,是一種條件性致病菌。在食品衛(wèi)生中,大腸埃希菌作為指示菌,根據(jù)食品中大腸埃希菌的有無來間接地判定食品被糞便污染的可能程度[1]。大腸埃希菌是人和許多動(dòng)物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細(xì)菌。它侵入人體一些部位時(shí),可引起感染,如腹膜炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等。人在感染大腸埃希菌后的癥狀為胃痛、嘔吐、腹瀉和發(fā)熱。感染可能是致命性的,尤其是對(duì)孩子及老人[2]。大腸埃希菌對(duì)食品的污染嚴(yán)重危害著人們的食品安全與健康。在對(duì)食品安全愈加重視的當(dāng)今社會(huì),由于化學(xué)防腐劑的安全性受到挑戰(zhàn),天然食品防腐劑備受青睞。開發(fā)廣譜、高效、安全的天然食品防腐劑,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。乳酸鏈球菌素(Nisin)、ε-聚賴氨酸和殼聚糖在食品防腐方面具有很好的殺菌效果,能夠有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖,延長(zhǎng)食品保質(zhì)期,是更加安全可靠的新一代食品防腐劑[3-5]。本實(shí)驗(yàn)的研究有望通過應(yīng)用生物防腐劑對(duì)大腸埃希菌進(jìn)行控制和殺滅,減少其對(duì)人體的危害以及在食品中的存活數(shù)量,提高人們的食品安全水平,保障人們的飲食健康。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 大腸埃希菌(Escherichia colis)AS1.487株,購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物所;

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB液體培養(yǎng)基(%)：牛肉膏0.5,蛋白胨1,NaCl 0.5,pH 7.2;②LB固體培養(yǎng)基(%)：牛肉膏0.5,蛋白胨1,NaCl 0.5,瓊脂1.5,pH 7.2。

1.1.3 防腐劑 Nisin、ε-聚賴氨酸、殼聚糖,分別購(gòu)自洛陽(yáng)市華健生物工程有限公司、浙江銀象生物有限公司、山東濰坊海之源生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與培養(yǎng) 將大腸埃希菌菌種接種于LB試管斜面培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24 h,將菌種活化。菌種經(jīng)活化后,接入LB液體培養(yǎng)基,37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 最小抑菌濃度測(cè)定 取經(jīng)16～18 h增菌培養(yǎng)的大腸埃希菌菌液100μL和1 mL LB液體培養(yǎng)基于試管中,加入防腐劑倍比稀釋,共稀釋12次,于37℃、150 r/min培養(yǎng)18～20 h后觀察并經(jīng)比色測(cè)定大腸埃希菌的生長(zhǎng)情況,以大腸埃希菌不生長(zhǎng)的稀釋度為最小抑菌濃度(M I C)。

1.2.3 殺菌動(dòng)力學(xué) 將經(jīng)過培養(yǎng)的大腸埃希菌菌液于1 500 r/min離心10 min,棄上清液,用50 mL無菌水收集菌液。取制備的大腸埃希菌細(xì)胞懸液分裝于12個(gè)試管中,每個(gè)試管5 mL菌液,向其中一組加5 mL無菌水作為空白,取其他3組試管加入抑菌劑5 mL,使試管中抑菌劑濃度為1 M IC,置于4℃冰箱中放置?？瞻自? h取樣倒平板,其余的分別在3、6、9 h取樣倒平板,將平皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后取出,菌落計(jì)數(shù)。

1.2.4 滅活優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)16～18 h的大腸埃希菌菌液100 mL于1 500 r/min離心10 min,棄上清液,用100 mL蒸餾水收集菌液,將菌液分裝于9組試管,每個(gè)試管0.5 mL,然后按正交表設(shè)計(jì)添加防腐劑用量,使其最終濃度為正交表中各水平濃度,最后用無菌水補(bǔ)足10 mL,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組,見表1。將試管于4℃冰箱中放置24 h后,每支試管取出0.1 mL,稀釋6個(gè)梯度,倒平板計(jì)數(shù)。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平L9(33)Table 1 Orthogonal factors and the level

1.2.5 應(yīng)用試驗(yàn) 取50 mL大腸埃希菌菌液于1 500 r/min離心10 min,棄上清液,用50 mL無菌水收集菌液。取2組試管,一組加3種抑菌劑的最佳配比(由正交實(shí)驗(yàn)得出),再加0.5 mL菌液,用美汁源果粒橙補(bǔ)足10 mL。另一組只加0.5 mL菌液,用牛奶補(bǔ)足10 mL。將試管放入冰箱中48 h,然后倒平板并計(jì)數(shù),計(jì)算殺菌率[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度

用液體倍比稀釋法測(cè)定M IC,測(cè)定結(jié)果顯示,殼聚糖、ε-聚賴氨酸、Nisin的M I C分別為10、2.5、0.078 mg/mL。

2.2 殺菌動(dòng)力學(xué)

通過平板計(jì)數(shù)法測(cè)定殼聚糖、ε-聚賴氨酸、Nisin對(duì)大腸埃希菌的殺菌動(dòng)力學(xué),結(jié)果見圖1。由圖1可以看出,殼聚糖組對(duì)菌落總數(shù)沒有影響;Nisin組效果比較明顯,菌落對(duì)數(shù)曲線明顯下降,3 h后下降趨于平緩;ε-聚賴氨酸組的菌落對(duì)數(shù)曲線下降明顯,3 h后效果減弱。結(jié)果表明,Nisin和ε-聚賴氨酸對(duì)大腸埃希菌的殺滅效果較明顯,而殼聚糖對(duì)大腸埃希菌幾乎沒有殺滅作用。

2.3 滅活優(yōu)化實(shí)驗(yàn)(正交法)

按L9(33)正交表設(shè)計(jì)添加防腐劑用量,優(yōu)化殺滅大腸埃希菌效果,結(jié)果見表2。由表2可知,Nisin的極差最大,對(duì)大腸埃希菌的抑制效果起主要影響作用,最佳處理組合：Nisin、ε-聚賴氨酸、殼聚糖的濃度分別為0.04、0.01、5 mg/mL。

圖1 Nisin、ε-聚賴氨酸和殼聚糖的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect ofNisin、ε-poly-L-lysine and chitosan

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

2.4 應(yīng)用實(shí)驗(yàn)

由于在不同的介質(zhì)中可能會(huì)影響防腐劑的抑菌效果,以果粒橙為介質(zhì)研究了復(fù)合Nisin、ε-聚賴氨酸、殼聚糖應(yīng)用效果實(shí)驗(yàn),顯示其殺菌率可達(dá)88.57%,3種抑菌劑的最佳組合對(duì)大腸埃希菌有明顯的殺滅作用。

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明,殼聚糖、Nisin、ε-聚賴氨酸的最小抑菌濃度分別為10、2.5、0.078 mg/mL。當(dāng)殼聚糖、Nisin、ε-聚賴氨酸的濃度分別為5、0.04、0.01 mg/mL時(shí)對(duì)大腸埃希菌的抑制作用最好,在這一最佳組合條件下對(duì)鮮乳介質(zhì)中的大腸埃希菌殺菌率達(dá)88.57%。

[1] 徐曉可,吳清平,周艷紅,等.肉類中大腸埃希菌O157：H7多重PCR檢測(cè)方法的建立[J].微生物學(xué)通報(bào),2008,35(4)：619-622

[2] 何國(guó)慶,賈英民.食品微生物學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2002：384-387.

[3] 蔣士龍.幾種化學(xué)防腐劑的安全性及鑒別方法[J].肉類工業(yè),2007,(11)：38-39.

[4] Belewu,M.A.,Belewu,K.Y.Nk wunonwo,C.C.Effect of biological and chemical preservatives on the shelf life of West African soft cheese[J].African Journal of Biotechnology,2005,4(10)：1076-1079.

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[6] Magnusson M,Svensson,B.Svensson.Bacillus cereus Spores During Housing of Dairy Cows：Factors Affecting Contamination of Raw Milk[J].Journal of Dairy Science,2007,90(6)：2745-2754.