楊秀榮,王雪蓮,王 敏,孫淑琴,劉水芳

(1.天津市植物保護研究所,天津 300112;2.天津科技大學生物工程學院,天津 300457)

從天津近郊蔬菜種植區(qū)分離篩選獲得1株生防細菌B579,經(jīng)初步鑒定為芽胞桿菌屬(B acillus spp.),試驗表明該菌在室內(nèi)平皿抑菌試驗和溫室盆栽試驗中均對土傳病害表現(xiàn)出明顯的防治效果[1],本研究旨在利用Plackett-Bur man和響應面等實驗設計確定及優(yōu)化該菌增殖的培養(yǎng)基[2],使單位體積活菌數(shù)增加,為后續(xù)的放大培養(yǎng)提供依據(jù)。Plackett-Burman設計法是一種2水平的實驗設計方法,它可以利用最少的實驗次數(shù),從眾多的考察因素中快速有效地篩選出主要的影響因子,因而被廣泛應用于因子主效應的估計中[3]。響應面法(Response Surface Methodology,RS M)是一種優(yōu)化生物過程的綜合技術,采用該法可以建立連續(xù)變量曲面模型[3-4],對影響生物產(chǎn)量的因子水平及其交互作用進行優(yōu)化與評價[4-5]。因此,它可快速有效地確定生物過程的最佳條件,該法已被廣泛用于培養(yǎng)基優(yōu)化實踐中[5-6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 生防細菌B579從天津近郊蔬菜種植田分離獲得,現(xiàn)保存于天津市植物保護研究所生防室。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯

200,葡萄糖(或蔗糖)20,瓊脂18,pH自然;②肉汁胨培養(yǎng)基：牛肉浸膏3,蛋白胨10,NaCl 5,pH 7.2;③LB培養(yǎng)基：蛋白胨10,酵母提取物5;NaCl 10;pH 7.2;④Plackett-Burman實驗發(fā)酵培養(yǎng)基：按照實驗設計配制;⑤RS M實驗發(fā)酵培養(yǎng)基：同上。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵實驗 將斜面培養(yǎng)1周的生防細菌B579接種到裝液量為30 mL的250 mL三角瓶中,37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h,使菌體處于對數(shù)生長期。然后以一定的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,在搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min和合適的溫度條件下恒溫培養(yǎng)24 h。

1.2.2 生防細菌B579菌體量的測定 將發(fā)酵液稀釋100倍后,在600 nm下用分光光度計測量其濁度。

1.2.3 Plackett-Bur man實驗設計 根據(jù)生防細菌B579生長所需營養(yǎng)的基本原則,結(jié)合相關文獻和前期的實驗,本實驗選取的影響因素共10個。因此,選用了N=12的PB設計表,各參數(shù)及其水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平及編碼Table 1 Level and code of variables for Plackett-Burman design

1.2.4 最陡爬坡實驗設計 根據(jù)擬合的一階模型回歸系數(shù)的符號和大小來設計顯著因素的最陡上升路徑,而其他因素的取值則根據(jù)Plackett-Burman實驗結(jié)果中各因素效應的正負和大小,正效應的因素均取較高值,負效應的因素取較低值[15]。

1.2.5 Box-Benhnken中心組合設計優(yōu)化培養(yǎng)基根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果,確定下一步試驗水平的中心點和各水平的步長。選取響應值為菌體量,自變量為顯著因子的水平,借助實驗設計軟件SAS,進行Box-Benhnken設計。

1.2.6 菌體數(shù)量的測定(活菌的計數(shù)法) 將發(fā)酵液在無菌條件下10倍稀釋至10-7、10-8、10-9,并將此3個稀釋度在無菌條件下,吸取1 mL于無菌平板中,每稀釋度重復3次。將滅菌后冷至不燙手的平板計數(shù)培養(yǎng)基倒入平板中(10～12 mL),迅速旋轉(zhuǎn)平板,混勻后使培養(yǎng)基鋪滿整個平板,凝固后倒置平板于30℃培養(yǎng)箱中,20 h后取出查菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響生防細菌B579增殖的重要因素

Plackett-Bur man試驗結(jié)果見表2,各因素方差分析見表3。從表3的概率P值大小可看出,對生防細菌B579菌株發(fā)酵液中的菌體量具有顯著影響的因子是黃豆餅粉、玉米粉和牛肉膏,考慮這3個因素的效應(t值)大小,確定它們?yōu)橄乱徊皆囼灥年P鍵因素。由于其他因子對響應值影響均不顯著,因此,在進一步篩選時正效應的因素均取較高值,負效應的因素取較低值。

表2 N=12的Plaekett-Burman實驗設計與響應值表Table 2 Design and response of N=12 Plackett-Bur man test

2.2 最陡爬坡試驗

表4列出了顯著因素的變化方向、步長和試驗結(jié)果。由表4可知,菌體量在0到(0+1Δ)之間有一個明顯的上升,之后開始下降,培養(yǎng)基成分最佳含量在(0+1Δ)和(0+2Δ)之間,故以(0+1Δ)條件為后續(xù)試驗中心點。

表3 Plackett-Burman試驗各因素參數(shù)分析Table 3 The parameter estimates of variables of Placktt-Burman design

表4 最陡爬坡實驗設計及結(jié)果Table 4 Experimental designs and the results of steepest ascent

2.3 Box-Benhnken實驗數(shù)據(jù)的確定

依據(jù)Plackett-Bur man實驗結(jié)果及最陡爬坡試驗,選取黃豆餅粉、玉米粉、牛肉膏作為響應面設計的變量,各因子及其編碼見表5,進一步借助實驗設計軟件SAS,進行Box-Benhnken設計。

2.4 Box-Benhnken實驗設計

依據(jù)Box-Benhnken設計所得響應值結(jié)果見表6,回歸方程中回歸系數(shù)估計值見表7,最終擬合的二次回歸方程式為：Y1=0.222-0.000 625 X1-0.000 125X2-0.000 5X3-0.011 375X1X1-0.001 25X1X2-0.01X1X3-0.006 375X2X2-0.001 5X2X3-0.009 125X3X3,通過模型的可信度分析(見表8),R2=0.997 3,離回歸標準差為0.000 671,說明該回歸方程的擬合程度較好。

表5 Box-Benhnken設計各因子及其編碼值Table 5 Assigned concentration of each variable at different levels in Box-benhnken design

表6 Box-Benhnken試驗設計方案及響應值Table 6 Design and response of Box-Benhnken

表7 回歸方程中回歸系數(shù)的估計值Table 7 Coefficient estimated value in regression equationdesign

表8 模型可信度分析Table 8 Reliability analysis in model

2.5 數(shù)據(jù)分析圖

依以上回歸方程繪制分析圖,可得圖1、圖2、圖3,從各圖可以看出,X1、X2和X3存在極點值。運用SAS對回歸模型進行規(guī)范性分析,尋找最優(yōu)相應區(qū),分析可知,回歸模型存在穩(wěn)定點(X1、X2、X3)為(30.2、31和23.5 g/L)。這說明X1(玉米粉)的最佳范圍為31 g/L,X2(牛肉膏)的最佳范圍為23.5 g/L,X3(黃豆餅粉)的最佳范圍為30.2 g/L。

圖1 Y=f(X1X2)響應面立體圖Fig.1 The stereogram of Y=f(X1X2)response surface analysis

圖2 Y=f(X1X3)響應面立體圖Fig.2 The stereogram of Y=f(X1X3)response surface analysis

2.6 驗證試驗

由以上試驗得到最優(yōu)配方：黃豆餅粉、玉米粉、牛肉膏分別在30.2、31和23.5 g/L的條件下,可使生防細菌B579獲得最大菌體量,驗證試驗證實了該方程的預測值與實際值之間吻合較好。優(yōu)化后的培養(yǎng)基使菌體量從起始LB培養(yǎng)基的7.3×109cfu/mL提高到8×1011cfu/mL,見表9。

圖3 Y=f(X2X3)響應面立體圖Fig.3 The stereogram of Y=f(X2X3)response surface analysis

表9 最優(yōu)培養(yǎng)條件下生防細菌B579菌量值Table 9 The number of bacteria in good condition

3 討 論

傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計方法(線性回歸分析和正交試驗設計)在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學研究中有著廣泛的應用。但存在一些缺點：線性回歸分析雖然可以利用實驗數(shù)據(jù)得出因素與指標(即響應值)之間的回歸方程,但要求數(shù)據(jù)量大,費時耗資,且只是討論一種因素的影響,無法綜合考慮幾種因素的綜合作用。正交試驗設計則注重如何科學合理地安排試驗,可同時考慮幾種因素,尋找最佳因素水平組合;但它不能在給出的整個區(qū)域上找到因素和響應值之間的一個明確的函數(shù)表達式,即回歸方程。從而無法找到整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應值的最優(yōu)值。因此期望找到一種試驗次數(shù)少、周期短,求得的回歸方程精度高、能研究幾種因素間交互作用的回歸分析方法,響應面分析方法在很大程度上滿足了這些要求,該方法既經(jīng)濟省力,優(yōu)化效率又高,且處理數(shù)據(jù)由計算機完成。數(shù)據(jù)中隱含的規(guī)律用立體圖直觀表示出來,并用數(shù)學模型描述,從而揭示深層次的規(guī)律。本文利用該方法獲得以黃豆餅粉、玉米粉、牛肉膏為主要影響因子的培養(yǎng)基及最佳配比,為生防細菌B579的進一步研究與開發(fā)應用奠定了基礎。

RSA有許多方面的優(yōu)點,但它仍有一定的局限性。首先,如果你將因素水平選的太寬,或選得關鍵因素不全,將會導致響應面出現(xiàn)吊兜或鞍點,因此試驗前進行充分的調(diào)研和預備性試驗是非常必要的。而且通過回歸分析得到的結(jié)果只能對該類試驗作估計。此外,當回歸數(shù)據(jù)用于預測時,只能在因素所限的范圍內(nèi)進行預測。

[1] 楊秀榮,王雪蓮,王敏,等.生防細菌B579對土傳病害的防治效果及促長作用[J].中國生物防治,2008,24(增刊)：59-61.

[2] 徐子鈞,李劍,梁鳳來,等.利用SAS軟件優(yōu)化L-乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基[J].微生物學通報,2004,31(3)：85-87.

[3] Kalil S J,Maugeri F,Rodrigues M I.Response surface analysis and simulation as a tool for bioprocess design and optimization[J].Process Biochemistry,2000,35：539-550.

[4] 王允祥,呂鳳霞,陸兆新.杯傘發(fā)酵培養(yǎng)基的響應曲面法優(yōu)化研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報,2004,27(3)：89-94.

[5] 劉建忠,熊亞紅,翁麗萍,等.生物過程的優(yōu)化[J].中山大學學報,2002,41(增刊)：132-137.

[6] Ramkrishna S,Swaminmhan T.Response surface modeling and optimization to elucidate and analyze the efects of inoculums age and size on surfactin production[J].Biochemical Engineering Journal,2004,21：141-148.