薛 清,段春梅,王玲娜,林雁冰＊

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,陜西楊凌 712100 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊凌 712100;)

放線菌是一類產(chǎn)生豐富生物活性物質(zhì)的重要微生物資源。放線菌是新的生物活性物質(zhì)的主要產(chǎn)生菌,放線菌資源研究對(duì)抗生素工業(yè)發(fā)展有重要影響。今天隨著放線菌生物多樣性研究的進(jìn)展,放線菌仍然具有產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)的極大潛力[1]。研究資料顯示,目前已分離出的放線菌僅占其自然界存在總量的10%～20%,大多數(shù)放線菌由于多種原因不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。要分離到更多的新放線菌類群,需要探索新的分離方法。目前,國內(nèi)外在放線菌分離方法研究方面已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展[2-8],研究發(fā)現(xiàn),采用多種物理、化學(xué)刺激以及改變培養(yǎng)基成分等措施[9-12],能有效提高稀有放線菌的出菌率,并分離出放線菌的新種屬[13-15]。微波是一種振蕩頻率為每秒24.5億次高頻電磁波。微波的加熱與殺菌作用已有大量研究,微波對(duì)生物體可以產(chǎn)生熱效應(yīng)、電效應(yīng)、磁效應(yīng)及化學(xué)效應(yīng)等,從而引起生物細(xì)胞多種生理生化變化或致死效應(yīng)[16]。從物理學(xué)和生物學(xué)原理推知,低強(qiáng)度微波輻射有可能消除抑制放線菌孢子萌發(fā)的某些制約因素,使部分不可培養(yǎng)放線菌的孢子萌發(fā),增加可培養(yǎng)放線菌的種類與數(shù)量。楊斌等[17]研究了微波處理不同有機(jī)質(zhì)含量沙質(zhì)土壤引起的放線菌數(shù)量變化,發(fā)現(xiàn)微波處理可以顯著增加放線菌的出菌率和拮抗性放線菌比例,但對(duì)鈣質(zhì)土壤及培養(yǎng)基加鈣后微波的處理效應(yīng)尚不清楚。本文重點(diǎn)探索中強(qiáng)度微波預(yù)處理對(duì)鈣質(zhì)土壤和培養(yǎng)基加CaCl2后土壤放線菌數(shù)量的影響,旨在為改善放線菌分離效果的微波預(yù)處理技術(shù)研究提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 供試土壤為栗鈣土,碳酸鈣含量為29.7～40.7 g/kg,采自內(nèi)蒙古自治區(qū)太仆寺旗寶昌鎮(zhèn)永勝村西芹田。其中,1～3號(hào)土樣為風(fēng)干土樣,4號(hào)土樣為4℃冰箱保存的濕土樣。土壤pH用DELTA 320pH計(jì)測(cè)定,有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測(cè)定,碳酸鈣用鹽酸氣量法測(cè)定[18]。土壤化學(xué)性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤化學(xué)性質(zhì)Table 1 The chemical properties of the soil tested

1.1.2 培養(yǎng)基 放線菌分離培養(yǎng)基：高氏1號(hào)培養(yǎng)基(GA)[19];高氏1號(hào)加鈣培養(yǎng)基(GA-Ca),即高氏1號(hào)培養(yǎng)基加入5 g/L的CaCl2;腐植酸瓊脂培養(yǎng)基HA[20]。以上培養(yǎng)基均在滅菌后加入滅菌的濃度為8 g/L的K2Cr2O7至80μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方案 試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理：對(duì)照土樣(CK)：不進(jìn)行微波輻照;微波處理(Microwave Irradiation,M I)：120W功率模式下微波輻照3 min。1.2.2 土壤預(yù)處理 1～3號(hào)土樣在自然狀態(tài)下風(fēng)干;4號(hào)土樣為濕土,4℃冰箱保藏。試驗(yàn)前將1～3號(hào)風(fēng)干稱5.0 g碾磨至細(xì)粉的土樣,加95 mL無菌水制成懸液;4號(hào)濕土樣直接稱5.0 g加95 mL無菌水制成懸液,同時(shí)測(cè)定土壤含水量,用于計(jì)算干土含菌量。微波處理：稱取磨細(xì)的1～3號(hào)干土和4號(hào)濕土各5.0 g置于10 mL塑料離心管中,加入3 mL無菌水濕潤(rùn)(使土壤能夠吸收微波);離心管放置于裝有500 mL、24℃自來水的水浴中(避免待處理土壤樣品因溫度升高產(chǎn)生溫度效應(yīng)),將放置土壤樣品的水浴置于微波爐內(nèi),以功率120 W模式處理3 min,再用滅菌針管吸取無菌水沖洗土樣,轉(zhuǎn)入裝有92 mL無菌水的三角瓶中,震蕩15 min分離測(cè)數(shù)。

1.2.3 放線菌分離計(jì)數(shù)及初步鑒定 將處理好的土壤懸液用10倍稀釋法稀釋,充分混勻后分別吸取0.1 mL滴加于GA、GA-Ca及HA平板上,重復(fù)3次。涂布均勻后在28℃下倒置培養(yǎng)10 d,計(jì)數(shù),并據(jù)菌落形態(tài)特征將具有鏈霉菌和小單孢菌菌落特征的放線菌暫定為“鏈霉菌屬”和“小單孢菌屬”,其余放線菌皆歸入“未鑒定屬”。同時(shí)挑取放線菌單菌落于高氏1號(hào)斜面中培養(yǎng)保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果計(jì)算 微波處理土壤放線菌數(shù)量與對(duì)照的相對(duì)差異用微波效應(yīng)EM I表示,計(jì)算公式如下：

式中Nm、Nck及EM I分別為微波處理、對(duì)照CK的放線菌數(shù)量及微波效應(yīng)。

試驗(yàn)結(jié)果顯著性分析采用DPS 9.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(T-檢驗(yàn))。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波對(duì)放線菌數(shù)量的影響

2.1.1 GA培養(yǎng)基 從表2可以看出,就GA培養(yǎng)基而言,微波處理能夠提高放線菌出菌率。其中,供試土樣放線菌總數(shù)較對(duì)照增加99.5%～234.1%,均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01);鏈霉菌較對(duì)照增加58.3%～377.7%,除3號(hào)土樣外均達(dá)到極顯著水平;對(duì)小單孢菌而言,1～3號(hào)干土增加94.7%～651.4%,其中2、3號(hào)土樣微波處理與對(duì)照的差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05),4號(hào)濕土較對(duì)照減少4.4%,與對(duì)照差異不顯著;未鑒定屬放線菌較對(duì)照增加96.7%～304.8%,均達(dá)到顯著(P＜0.05)或極顯著水平(P＜0.01)。

表2 微波處理后高氏1號(hào)培養(yǎng)基上放線菌的分離數(shù)量(105cfu/g)Table 2 The quantity of actinomycetes isolated from the medium of GA aftermicrowave irradiation(105cfu/g)

2.1.2 GA-Ca培養(yǎng)基 微波處理后GA-Ca培養(yǎng)基上放線菌出菌率也有不同程度增加,見表3。其中放線菌總數(shù)較對(duì)照增加8.8%～180.6%,均達(dá)到極顯著(P＜0.01)或顯著水平(P＜0.05);鏈霉菌總數(shù)較對(duì)照增加17.7%～151.3%,其中2號(hào)和3號(hào)土樣達(dá)到極顯著水平(P＜0.01);小單孢菌增加2.3%～420.0%,其中2號(hào)和3號(hào)土樣達(dá)到顯著水平(P＜0.05);未鑒定屬增加8.8%～234.5%,除4號(hào)土外,其余土壤樣品均達(dá)顯著(P＜0.05)或極顯著水平(P＜0.01)。

表3 微波處理后GA-Ca培養(yǎng)基上的放線菌數(shù)量(105cfu/g)Table 3 The quantity of actinomycetes isolated from the medium of GA-Ca aftermicrowave irradiation(105cfu/g)

2.1.3 HA培養(yǎng)基 HA培養(yǎng)基為鏈霉菌的選擇性培養(yǎng)基。微波處理后,HA培養(yǎng)基上鏈霉菌分離數(shù)量增加顯著,見表4。4種土樣較對(duì)照增長(zhǎng)79.0%～126.0%,均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。說明微波處理能夠顯著增加HA培養(yǎng)基上鏈霉菌的數(shù)量。

表4 微波處理后腐植酸培養(yǎng)基上鏈霉菌分離數(shù)量(105cfu/g)Table 4 The quantity ofStreptomycetesisolated from the medium of HA aftermicrowave irradiation(105cfu/g)

由以上分析可看出,采用低強(qiáng)度微波對(duì)土壤進(jìn)行預(yù)處理可以增加放線菌的出菌率,大多數(shù)土樣的處理效應(yīng)達(dá)到顯著或極顯著水平,在3種培養(yǎng)基上的結(jié)果表現(xiàn)出基本相同的趨勢(shì)。

2.2 不同培養(yǎng)基上的微波效應(yīng)

從圖1可以看出,在不同培養(yǎng)基上EM I不同,其變化呈現(xiàn)出基本相同的趨勢(shì)：對(duì)放線菌總數(shù)、未鑒定屬放線菌及2號(hào)和3號(hào)土樣的小單孢菌數(shù)量而言,EM I均表現(xiàn)為GA＞GA-Ca;對(duì)鏈霉菌數(shù)量表現(xiàn)為GA＞HA＞GA-Ca。微波處理后,GA培養(yǎng)基上放線菌總數(shù)的EM I最大,GA上4個(gè)土樣處理后的EM I分別較GA-Ca培養(yǎng)基上處理后提高77.1%、120.9%、26.4%及90.7%;GA培養(yǎng)基上1、2、4號(hào)土壤鏈霉菌數(shù)量的EM I分別較HA培養(yǎng)基上鏈霉菌數(shù)量的EM I提高173.6%、139.8%、75.3%,即培養(yǎng)基成分影響微波效應(yīng)。

2.3 土樣含水量對(duì)微波效應(yīng)的影響

從圖1中1～3號(hào)干土與4號(hào)濕土(含水量415 g/kg)的微波增率對(duì)比可以看出,微波處理后濕土中放線菌總數(shù)、未鑒定放線菌數(shù)量的EM I均小于1～3號(hào)干土,其中4號(hào)土GA上放線菌總數(shù)的EM I較1～3號(hào)土樣分別減少134.6%、201.9%、65.9%;在GA-Ca培養(yǎng)基上放線菌總數(shù)的EM I分別減少148.16%、171.7%、130.2%;除3號(hào)土的在GA培養(yǎng)基上的測(cè)值外,1～3號(hào)土壤在GA、GA-Ca培養(yǎng)基上鏈霉菌數(shù)量的EM I也符合濕土小于干土的趨勢(shì);在HA培養(yǎng)基上,1、2、3號(hào)土壤鏈霉菌數(shù)量的EM I分別減少65.2%、158.9%、47.0%,即冰箱4℃保藏的含水量較高的新鮮土樣的EM I應(yīng)低于風(fēng)干土壤,其原因尚不清楚。

圖1 供試土壤不同培養(yǎng)基上微波處理后放線菌數(shù)的微波效應(yīng)Fig.1 The EM Iof the quantity of the actinomycetes on the differentmedia in the tested soil aftermicrowave irradiation

3 討 論

為了分離到更多的新放線菌種類,很多學(xué)者不斷對(duì)放線菌分離方法進(jìn)行探索,研究工作主要集中在樣品預(yù)處理、抑制劑選擇以及改變培養(yǎng)基成分等方面。樣品預(yù)處理包括物理方法處理與化學(xué)方法處理?；瘜W(xué)方法主要是通過添加適當(dāng)濃度的某種化學(xué)抑制劑,抑制鏈霉菌的生長(zhǎng),或者加入孢子激活劑,促進(jìn)孢子萌發(fā),從而選擇性地分離出稀有放線菌。如姜怡等[9]向土壤懸液加入6%的酵母膏和0.05%的十二烷基磺酸鈉混合液,在40℃處理20 min,能有效地分離到小單孢菌屬、鏈孢囊菌屬、馬杜拉菌屬及小雙孢菌屬等稀有放線菌。物理方法主要有干熱預(yù)處理[21]、超聲波振蕩、土壤懸液差速離心法以及極高頻輻射法等[9]。Li等[10]使用1 kHz以上的極高頻射線(EHF)對(duì)土壤懸液進(jìn)行照射,發(fā)現(xiàn)在波長(zhǎng)8～11.5 mm時(shí),各稀有放線菌總數(shù)較對(duì)照提高了7.5倍。Li等[11]使用連續(xù)照射與極高頻輻射結(jié)合的方法,發(fā)現(xiàn)在波長(zhǎng)為4.6～5.8 mm及8～11.5 mm時(shí),放線菌總數(shù)與稀有放線菌的種類及數(shù)量大幅度提高。Likhacheva等[12]用超高頻輻射法(SHF)對(duì)幾種鏈霉菌孢子懸液進(jìn)行不同時(shí)間的預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)不同處理時(shí)間鏈霉菌的生物量以及活性均受到不同程度的影響。微波是一種高頻電磁波,利用微波殺菌已有大量研究及應(yīng)用。但用微波處理改善放線菌分離效果研究很少,國外僅有Bulina等[2]將其應(yīng)用于放線菌分離的初步研究報(bào)道,該研究發(fā)現(xiàn),小功率、短時(shí)間微波處理對(duì)放線菌分離效果有一定影響,使用80 W微波對(duì)土壤懸液處理30 s時(shí)能有效提高小單孢菌屬、小多孢菌屬、諾卡氏菌屬及馬杜拉菌屬等稀有放線菌的比率。楊斌等[17]研究了微波處理時(shí)間對(duì)不同有機(jī)質(zhì)含量沙質(zhì)土壤放線菌分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)微波處理后高有機(jī)質(zhì)土壤放線菌總數(shù)、鏈霉菌數(shù)以及小單孢菌數(shù)較對(duì)照有一定程度的增加,120 W中等強(qiáng)度、3 min條件下處理效果最好。本試驗(yàn)研究了該條件下微波處理鈣質(zhì)土壤對(duì)放線菌分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)微波處理后絕大部分供試鈣質(zhì)土壤在GA、GA-Ca及HA 3種培養(yǎng)基上的放線菌總數(shù)、鏈霉菌數(shù)、小單孢菌及未鑒定放線菌數(shù)量均有明顯增加,與楊斌等微波處理不同有機(jī)質(zhì)含量沙質(zhì)土壤時(shí)得到的結(jié)果[17]一致,表明微波處理土壤對(duì)放線菌分離時(shí)出菌量的提高效果具有較為廣泛的一致性。

另外,本研究探討了微波處理對(duì)鈣質(zhì)土壤放線菌在不同培養(yǎng)基上分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)加鈣培養(yǎng)基(GA-Ca)上的微波效應(yīng)(EM I)小于高氏1號(hào)培養(yǎng)基(GA),該結(jié)果說明加鈣也能提高放線菌的出菌率。鑒于在現(xiàn)有分離方法和條件下,土壤中可培養(yǎng)放線菌的數(shù)量是一定的,如果加鈣激活一部分孢子,剩余的待微波激活的孢子量就會(huì)減少,導(dǎo)致在加鈣培養(yǎng)基GA-Ca上的EM I小于高氏1號(hào),該推論尚待進(jìn)一步證實(shí)。

在本研究中,將待處理土壤樣品置于裝水量500 mL、24℃的水浴中,消除了微波處理期間加熱引起樣品溫度升高產(chǎn)生的熱效應(yīng),故本研究中微波處理對(duì)放線菌出菌率的影響主要來自微波高頻電磁波的生物效應(yīng)。初步推斷,微波對(duì)放線菌出菌率的增加可能與放線菌孢子的通透性改變有關(guān)。短時(shí)間微波處理濕土可能改變細(xì)胞膜的通透性,影響水分和養(yǎng)分進(jìn)入孢子,促進(jìn)部分難萌發(fā)孢子萌發(fā),增加出菌量,本研究中風(fēng)干土樣的微波處理效應(yīng)大于濕土樣的結(jié)果也支持微波處理影響孢子膜透性的推斷。但上述推論及微波增加放線菌出菌量的詳細(xì)機(jī)理尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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