蔣冬花,徐曉波,葉瑩瑩,嵇 豪,蔡琪敏

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

酵母菌是一類重要的微生物,對(duì)其分類與鑒定是人類開(kāi)發(fā)利用的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的酵母菌鑒定方法所依賴的形態(tài)和生理生化特征均是表型性狀,會(huì)隨著環(huán)境的變化有所改變,這樣就會(huì)造成菌株鑒定結(jié)果的不穩(wěn)定性。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的引入給微生物分類鑒定帶來(lái)了積極的推動(dòng)作用,使分類鑒定工作由一般的表型特征鑒定深化到分子水平和遺傳特征的鑒定。SRAP是一種基于PCR技術(shù)的新的DNA分子標(biāo)記,由Li和Quiros[1]于2001年提出,具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率和容易得到選擇條帶序列的特點(diǎn)。SRAP利用其獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)基因組的開(kāi)放閱讀框(ORFs)進(jìn)行特異擴(kuò)增,上游引物長(zhǎng)17 bp,對(duì)外顯子進(jìn)行特異擴(kuò)增,下游引物長(zhǎng)18 bp,對(duì)內(nèi)含子區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增,因個(gè)體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子和間隔序列的不同,產(chǎn)生基于內(nèi)含子和外顯子的SRAP多態(tài)性[2]。用于SRAP實(shí)驗(yàn)的引物包括1個(gè)含17個(gè)堿基的正向引物(F-pr imer)和1個(gè)含18個(gè)堿基的反向引物(R-primer),正向引物含有一段14個(gè)堿基的核心序列,5′端前10個(gè)為填充序列TGAGTCCAAA,無(wú)任何特異組成,接著為CCGG序列,隨后3′端為3個(gè)不同的選擇性堿基,與相同的核心序列組成一套正向引物。反向引物的5′端前11個(gè)為填充序列GACTGCGTACG,接著為AATT,隨后3′端同樣為3個(gè)不同的選擇性堿基[3-4]。SRAP標(biāo)記已經(jīng)在馬鈴薯、水稻、蘋(píng)果、柑橘類果樹(shù)、櫻桃、梅子、油菜、大蒜、萵苣和棉花等[5-9]植物研究中得到了應(yīng)用,具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率的特點(diǎn),在基因組中分布均勻,適合基因定位、基因克隆等分子生物學(xué)研究。但是在真菌中的應(yīng)用很少,尤其是在酵母菌中的應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用SRAP標(biāo)記對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的19株待鑒定的酵母進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定,檢測(cè)這種分子標(biāo)記技術(shù)用于酵母菌菌種鑒別的可行性,為酵母菌的遺傳分析和分類研究提供DNA水平的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 從梨、蘋(píng)果、葡萄、獼猴桃等水果表皮不同部位,果園土、泡菜、酒曲等場(chǎng)所分離篩選純化得到18株酵母菌菌株,分別編號(hào)為Y-2～Y-19;浙大紫金港微生物實(shí)驗(yàn)室提供標(biāo)準(zhǔn)啤酒酵母(Saccharom yces cerevisiae)菌株作為參照菌株,并將其編號(hào)為Y-1。

1.1.2 試劑 用于SRAP-PCR反應(yīng)的dNTPs、TaqDNA聚合酶及DL 2000TMDNA Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。本實(shí)驗(yàn)使用的引物包括8個(gè)正向引物和11個(gè)反向引物,共組合成88個(gè)引物對(duì),其序列見(jiàn)表1,引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 SRAP實(shí)驗(yàn)的引物序列Table 1 Sequences of primers used in SRAP analysis

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 使用T IANamp YeastDNA Kit提取酵母基因組DNA,試劑盒購(gòu)于北京科百奧生物科技有限責(zé)任公司。用0.8%的瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量,通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度,并將DNA濃度稀釋為50 ng/μL。

1.2.2 引物的篩選 通過(guò)組合8對(duì)正向引物和11對(duì)反向引物得到88對(duì)引物組合,利用這些引物組合對(duì)酵母Y-1進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),從中篩選出帶形清晰,多態(tài)性豐富的引物。擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25μL,含50 ng模板DNA,50 ng引物,1.5 μL dNTPs(2.5 mmol/L),2.0μLMgCl2(25 mmol/L),1.0 UTaqDNA聚合酶,1×PCR緩沖液。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,擴(kuò)增5個(gè)循環(huán);94℃變性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)[10-11]為確定PCR反應(yīng)中各因素最佳水平,以酵母Y-1的DNA為模板,使用1.2.2所得結(jié)果的引物組合,采用L16(45)正交法,對(duì)影響SRAP擴(kuò)增的主要因素Mg2+、dNTPs、DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶設(shè)計(jì)5因素4水平的正交試驗(yàn),以確定PCR電泳分析的最佳條件。正交設(shè)計(jì)中的16個(gè)處理重復(fù)3次,PCR反應(yīng)各因素水平見(jiàn)表2和表3。

表2 SRAP-PCR體系因素-水平Table 2 SRAP-PCR factors-levels

表3 SRAP-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(L16(45))Table 3 SRAP-PCR orthogonal design(L16(45))

續(xù)表

1.2.4 DNA多樣性聚類分析 在最適條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中分離獲得擴(kuò)增圖譜,根據(jù)同一位點(diǎn)帶的有無(wú)編成1,0矩陣輸入計(jì)算機(jī),用NTSYSpc軟件中的S IMQUA I程序計(jì)算菌株間的相似系數(shù),然后用UPG MA法進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建相似聚類樹(shù)狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 引物篩選結(jié)果

用88對(duì)SRAP引物對(duì)酵母Y-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中me2-em7、me2-em10、me3-em4、me3-em6、me3-em8、me4-em2、me4-em5、me4-em9、me4-em10、me5-em7、me5-em8、me5-em10、me6-em8、me8-em5共14對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶清晰、重復(fù)性和穩(wěn)定性好且多態(tài)性條帶相對(duì)較多,因此選用上述14對(duì)引物進(jìn)行19個(gè)供試菌株的SRAP擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)(圖1)。

圖1 部分SRAP引物篩選結(jié)果Fig.1 Result of primers screening for SRAP

2.2 PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果分析

按表3設(shè)計(jì)的16個(gè)處理進(jìn)行PCR試驗(yàn),電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2,使用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ進(jìn)行結(jié)果分析,極差分析結(jié)果見(jiàn)表4。依據(jù)瓊脂糖電泳條帶的強(qiáng)弱和雜帶的多少進(jìn)行直觀分析。PCR的擴(kuò)增結(jié)果是dNTPs、引物、DNA模板、Mg2+和Taq酶等因素綜合作用的結(jié)果。從表4中可以看出,極差R值越大,說(shuō)明該因素對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果影響越大,因此5個(gè)因素水平變化對(duì)SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響從大到小依次為dNTPs濃度＞引物濃度＞DNA模板濃度＞Mg2+濃度＞Taq酶濃度,即dNTPs濃度的影響最為顯著。

2.2.1 dNTPs濃度對(duì)于PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響dNTPs濃度在150μmol/L時(shí)擴(kuò)增效果最好,之后呈現(xiàn)直線下降趨勢(shì),每2個(gè)水平之間差異都達(dá)到顯著水平。由關(guān)系曲線的波動(dòng)幅度可知(圖3),dNTPs濃度對(duì)PCR結(jié)果影響較大。本實(shí)驗(yàn)選擇峰值150μmol/L為最佳反應(yīng)水平。

2.2.2 引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響 引物濃度為0.2μmol/L和0.3μmol/L在水平間表現(xiàn)無(wú)顯著差異,但是兩者均與0.4μmol/L、0.5 μmol/L在水平間差異顯著。引物的濃度高低會(huì)影響產(chǎn)物的特異性,最佳引物濃度一般在0.1～0.5μmol/L,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為最佳,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且會(huì)增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。因此,應(yīng)選擇拐點(diǎn)0.3μmol/L為最佳水平(圖3)。

2.2.3 模板DNA濃度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響模板DNA的濃度和純度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果都會(huì)有一定的影響,DNA濃度過(guò)低,可能導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定及擴(kuò)增條帶模糊;濃度過(guò)高,則可能使引物或dNTPs過(guò)早耗盡,底物過(guò)量擴(kuò)增,過(guò)早進(jìn)入線性階段,出現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定的假象。如圖3所示,當(dāng)DNA取峰值30 ng/25μL時(shí),反應(yīng)體系穩(wěn)定,在保證擴(kuò)增效果的前提下,應(yīng)盡量降低模板DNA的用量,因此,最終選定30 ng/25μL作為本實(shí)驗(yàn)的最佳反應(yīng)水平。

2.2.4 Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響Mg2+濃度影響PCR擴(kuò)增的多個(gè)方面,如DNA聚合酶的活性,這會(huì)影響PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量;再如引物退火,這會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。dNTPs和模板DNA同Mg2+結(jié)合,降低了酶活性所需要的游離Mg2+的量。最佳的Mg2+濃度對(duì)于不同的引物和模板都不同。如圖3所示,Mg2+濃度在2.0 mmol/L與2.5 mmol/L水平間差異不顯著,與其他兩個(gè)濃度在水平間差異顯著。較高的游離Mg2+濃度會(huì)增加非特異性擴(kuò)增,降低忠實(shí)性;Mg2+濃度過(guò)低會(huì)降低Taq酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。綜合各因素最終確定2.0 mmol/L為最佳水平。

2.2.5 Taq酶濃度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響 在100μL的典型PCR反應(yīng)體系中,Taq聚合酶的用量一般為1～2.5單位,Taq聚合酶含量偏少時(shí)PCR產(chǎn)物相應(yīng)減少,而Taq聚合酶含量過(guò)高時(shí)則會(huì)增加非特異性擴(kuò)增的機(jī)會(huì)。如圖3所示,Taq聚合酶各水平間差異均不明顯,說(shuō)明Taq聚合酶在本實(shí)驗(yàn)所選梯度范圍內(nèi)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果影響較小。由圖2可知,當(dāng)Taq聚合酶濃度為1.5 U時(shí),反應(yīng)體系不穩(wěn)定。因此,本實(shí)驗(yàn)最終選定Taq聚合酶濃度2.5 U/25μL作為最佳反應(yīng)水平。

2.2.6 SRAP-PCR擴(kuò)增最佳反應(yīng)體系 通過(guò)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),得到用于酵母菌種分類的SRAPPCR擴(kuò)增反應(yīng)的最佳體系。25μL反應(yīng)體系包括：dNTPs 150μmol/L,引物0.3μmol/L,模板DNA 30 ng,Mg2+2.0 mmol/L,Taq聚合酶2.5 U。

表4 SRAP-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)極差分析/L16(45)Table 4 The range analysis of SRAP-PCR orthogonal design/L16(45)

2.3 SRAP擴(kuò)增結(jié)果

在最適的SRAP擴(kuò)增條件下,對(duì)供試的19株酵母菌的DNA進(jìn)行了14對(duì)引物的SRAP擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)(3次)擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定。部分引物組合對(duì)供試菌株的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4～圖8。

圖8 引物me4-em9對(duì)供試菌株的擴(kuò)增結(jié)果Fig.8 Amplification products generated from tested strainswith primerme4-em9

表5 19株酵母菌株SRAP擴(kuò)增的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)Table 5 Total bands and polymorphic bands resulting from SRAP

14對(duì)引物共擴(kuò)增出279條帶,其中92.5%呈多態(tài)性(見(jiàn)表5),每對(duì)引物平均擴(kuò)增出20條帶。引物組合me4-em9擴(kuò)增出來(lái)的總條帶最多為27條,多態(tài)性條帶為25條。引物組合me3-em4、me4-em2、me6-em8和me8-em5擴(kuò)增出來(lái)的多態(tài)性條帶比例最高,都達(dá)到了100%,可以將19株酵母菌株完全區(qū)別開(kāi)來(lái)。以上述14對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物圖譜為依據(jù),對(duì)供試的19株酵母菌株進(jìn)行聚類分析。

2.4 SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物聚類分析

采用NTSYSpc軟件中的S IMQUA I程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析計(jì)算兩兩菌株間的遺傳相似系數(shù)。供試的19個(gè)酵母菌株相似系數(shù)范圍為0.60～1.00。與ISSR的鑒定結(jié)果類似,Y-12酵母與其他酵母的相似系數(shù)較低。相似系數(shù)最高的菌株是Y-2和Y-4,兩者的相似系數(shù)達(dá)到了1.00。

圖9 SRAP聚類分析樹(shù)形圖Fig.9 Dendrogram based on SRAP fingerprints

如圖9所示,在相似水平為71%處時(shí),供試的19株酵母菌株被劃分為4個(gè)類群。第Ⅰ群：Y-6、Y-18、Y-14、Y-7、Y-2、Y-4;第Ⅱ群：Y-12;第Ⅲ群：Y-3、Y-11、Y-16、Y-5、Y-8、Y-13、Y-17、Y-1、Y-19、Y-10、Y-9;第Ⅳ群：Y-15。

3 討 論

SRAP是一種新型的分子標(biāo)記技術(shù),已經(jīng)成功地應(yīng)用在多種植物的研究中,它適于在不同作物上用于各種目的的研究[12]。對(duì)于SRAP分子標(biāo)記技術(shù)而言,不同的材料所需要的PCR反應(yīng)體系是不同的,為了讓所選菌種擴(kuò)增出理想的產(chǎn)物,必須優(yōu)化PCR反應(yīng)體系[13]。模板濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度和退火溫度等因素都會(huì)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生影響,本次試驗(yàn)中dNTPs濃度和引物濃度是主要影響因素。SRAP擴(kuò)增獲得的條帶十分豐富,該分子標(biāo)記技術(shù)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物為基因區(qū)域,這意味著將不能揭示非基因區(qū)域的遺傳多樣性[12]。形態(tài)上有明顯差異的菌株,SRAP擴(kuò)增條帶也有明顯區(qū)別,但是,形態(tài)上相似的菌株之間譜帶差異很小,種內(nèi)菌株之間幾乎是沒(méi)有差異的。對(duì)于SRAP分子標(biāo)記技術(shù)而言,引物組合的選擇是關(guān)鍵,正向引物和反向引物的自由組合不僅增加了引物的多樣性,而且節(jié)省了引物合成的成本,本文中使用的SRAP引物是目前文獻(xiàn)中報(bào)道的部分標(biāo)準(zhǔn)引物序列[13-14]。本研究結(jié)果顯示,不同的SRAP引物組合對(duì)不同酵母菌種間的區(qū)分度有所不同。在利用該標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行分類鑒定及親緣關(guān)系研究時(shí),應(yīng)盡量選用多種引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),在綜合大量譜帶信息的基礎(chǔ)上在進(jìn)行聚類分析。

本研究利用SRAP分子標(biāo)記獲得的多態(tài)性條帶,對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離純化得到的19株酵母菌在一定的程度上進(jìn)行區(qū)分,比較適合于酵母菌的種間鑒別。要將這19株酵母菌準(zhǔn)確鑒定到種的水平,還需結(jié)合其他輔助手段一起進(jìn)行,如26S r DNA D1/D2區(qū)序列分析和5.8S rDNA-ITS區(qū)域的PCRRFLP分析等,每種技術(shù)手段都有各自的優(yōu)缺點(diǎn),多種技術(shù)手段的結(jié)合才能大大提高酵母菌種鑒定的準(zhǔn)確性。本研究對(duì)SRAP分子標(biāo)記技術(shù)的成功應(yīng)用為今后酵母菌屬真菌的種系鑒定、遺傳多樣性研究、指紋圖譜構(gòu)建以及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等奠定了重要基礎(chǔ)。

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