楊 娟 徐國興

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纈沙坦對兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞的影響

楊 娟 徐國興

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科中心

目的：通過研究纈沙坦對兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞生長的影響，以期尋找藥物治療、延緩PVR的發(fā)生、發(fā)展。方法：體外培養(yǎng)兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞，取第三代細胞加入96孔板，分為①正常對照組；②血小板源性生長因子（PDGF）刺激組： 50μg/L PDGF；③纈沙坦（Valsartan）治療組：0.2mg/mL Valsartan+50μg/L PDGF。分別行MTT法檢測兔RPE細胞增殖能力，ELASA法檢測兔RPE細胞培養(yǎng)液TGF-β1含量。結(jié)果：PDGF刺激組兔RPE細胞的增殖速度加快，而Valsartan治療組對PDGF刺激后的兔RPE生長有明顯抑制作用，且明顯抑制PDGF刺激兔RPE細胞分泌TGF-β1。結(jié)論：Valsartan可抑制體外培養(yǎng)的兔RPE細胞生長。

纈沙坦 視網(wǎng)膜色素上皮細胞 抑制生長

增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinopathy, PVR）是玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)后產(chǎn)生的一種視網(wǎng)膜玻璃體纖維組織增生性病變，是導(dǎo)致玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)失敗的最常見原因，故抑制、延緩PVR的產(chǎn)生是提高玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)成功率的關(guān)鍵[1]。纈沙坦（valsartan）是一種血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，實驗研究顯示血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑能有效減輕組織纖維化程度，從而抑制肝臟、腎臟、心臟、胰腺等臟器的纖維化[2]。已有研究證實視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）細胞在PVR中起主導(dǎo)作用[3]，本實驗通過研究Valsartan對RPE細胞生長的影響，旨在證實Valsartan能否抑制RPE生長而在PVR中起類似的抗纖維化作用，以期尋找藥物治療、延緩PVR的發(fā)生、發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材料

美國Forma CO2培養(yǎng)箱、蘇州超凈工作臺、日本OLYMPUS倒置相差顯微鏡、美國Metertech公司Σ550型酶聯(lián)免疫檢測儀、太倉HZ-8211K恒溫振蕩儀、北京精利LCZ-5-2型低溫自動平衡離心機。DMEM／F12培養(yǎng)基、胎牛血清、小牛血清（均為Gibco公司）、TGF-β1測定ELASA試劑盒（南京建成生物工程研究所）

1.2 兔RPE細胞體外培養(yǎng)與鑒定

參照本科室建立的方法[4]。

1.3 MTT法檢測兔RPE細胞增殖能力

將第3代兔RPE細胞按1×103/孔個接種于96板，每孔培養(yǎng)體積為200μL。隨機分三組：①正常對照組；②PDGF刺激組：50μg/L PDGF；③Valsartan 治療組：0.2mg/mL Valsartan+50μg/L PDGF。從接種次日開始，每天將各組中的4孔細胞進行吸光度值測定，共測7天，每天換液一次。測定時每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，加入二甲亞砜150μL，震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm處測定各孔吸光度值（OD值）。

1.4 ELASA法檢測兔RPE細胞培養(yǎng)液TGF-β1含量

將第3代兔RPE細胞接種于96板，每孔培養(yǎng)體積為200μL，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育72h后，隨機分三組：①正常對照組；②PDGF刺激組： 50μg/l PDGF；③Valsartan 治療組：0.2mg/ml Valsartan+50μg/l PDGF，每組設(shè)4個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72h后，取上清液用ELASA法測定TGF-β1含量，操作按試劑盒進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以?±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。兔RPE細胞增殖實驗采用析因方差分析，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用檢驗，p<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Valsartan抑制PDGF刺激兔RPE細胞增殖。經(jīng)析因方差分析,三組差異具有顯著性（=34.620，＝0.000）；不同時間點對細胞體外增殖的影響差異具有顯著性（=107.860，＝0.000）；各組細胞與各時間組兩因素交互效應(yīng)顯著（=89.55，＝0.000）；除第1、2天外，其他各時間點細胞組間的細胞增殖差異具有顯著性（表1）。經(jīng)LSD 法多重比較，結(jié)果表明，與正常對照組相比較，PDGF刺激組兔RPE細胞的增殖速度加快，而Valsartan治療組對PDGF刺激后的兔RPE生長有明顯抑制作用。

表1 不同處理因素、不同時間點對兔RPE細胞增殖的影響（X±s，n=4）

注：*主效應(yīng)的統(tǒng)計量和值；＃交互效應(yīng)的統(tǒng)計量和值。

2.2 Valsartan抑制PDGF刺激兔RPE細胞分泌TGF-β1

PDGF刺激兔RPE細胞大量分泌TGF-β1，與正常對照組比有顯著性差異，而Valsartan則明顯抑制PDGF刺激兔RPE細胞分泌TGF-β1（表2）。

表2 不同處理因素對兔RPE細胞分泌TGF-β1的影響 （ng/L，X±s，n=4）

注：值為165.759，值為0.000，*與正常對照組比0.000，#與PDGF刺激組比0.000。

3 討論

PVR是玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)失敗的主要原因，且迄今為止無特別有效的治療手段。PVR的發(fā)生機理是由視網(wǎng)膜表面及玻璃體內(nèi)細胞的增殖，主要是RPE細胞、膠原細胞及成纖維細胞增殖形成增殖膜，增殖膜收縮引起視網(wǎng)膜脫離（RD）導(dǎo)致視力喪失。大量研究表明RPE細胞在PVR的發(fā)生發(fā)展過程中起主導(dǎo)作用，RPE通過分化、轉(zhuǎn)分化，分泌細胞因子，表達細胞因子受體，參與細胞外基質(zhì)形成通過復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)引發(fā)“瀑布式”級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致PVR的發(fā)生[5]。TGF-β1即是PVR病理過程中的主要作用因子之一。在PVR病理過程中PDGF分泌增加，并刺激RPE增殖，促進PVR進展。

纈沙坦（Valsartan）是一種血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，臨床上廣泛用于治療高血壓病，是一種安全有效的降壓藥物。最近的實驗室研究顯示血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑能有效減輕組織纖維化程度，有效抑制肝臟、腎臟、心臟、胰腺等臟器的纖維化，其機制可能與抑制組織細胞內(nèi)的TGF-β1及TGFRⅡmRNA表達有關(guān)。

TGF-β1已有實驗證明在PVR形成過程中起復(fù)雜的雙向調(diào)節(jié)作用，不同濃度時對RPE細胞分別表現(xiàn)出促進或抑制作用。TGFβmRNA及其蛋白水平的升高可使視網(wǎng)膜色素上皮細胞分泌釋放多種生長因子，刺激活化的巨噬細胞和成纖維細胞，使其產(chǎn)生膠原和纖維粘連蛋白等物質(zhì)，導(dǎo)致PVR的進展。

本實驗初步證實Valsartan可通過抑制RPE表達、分泌TGF-β1，抑制RPE增殖。作用機制需進一步實驗室研究，Valsartan對PVR的抑制作用有待進一步體外動物實驗證實。

[1] Pastor CJ,Proliferative vitreoretinopathy;an overview[J].Surv Ophthalmol,1998,43(1):3-18.

[2]姜美華,涂玲,徐西振,等.心肌纖維化細胞模型的構(gòu)建及纈沙坦對其治療的研究[J].醫(yī)學(xué)導(dǎo)報.2008,27(7):739-742.

[3] Casaroli-Marano RP,Pagan R,Vilaro S.Epithelial-mesenchymal transition in proliferative vitreoreinopathy:intermediate filament protein expression in retinal pigment epithelial cells.Invest Ophthalmol[J]. Vis Sci,1999,40(9):2062-2072.

[4] 徐國興,楊娟,孫堂勝,等.體外原代培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞[J].國際眼科雜志,2004,4(1):12-15.

[5] Xu GX,Thoreson WB. Effects of lysophosphatidic acid on DNA synthesis and proliferation in cultured human retinal pigment epithelial cells[J]. Investigative Ophthalmology&Visual Science (suppl),1997,38（3）:671.

1.福建省衛(wèi)生廳青年科研基金（編號2007-29）；2.福建省重點科研課題（基金編號2008Y0040）。