王婷婷 徐國興何青黃 焱
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華蟾素對晶狀體上皮細胞增殖及DNA結構的影響
王婷婷1,2徐國興1,2何青1,2黃 焱3
1.福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院眼科中心 2.福建省眼科研究所 3.福建醫(yī)科大學技術工程學院眼科學與視光學系
目的:探討華蟾素對兔晶狀體上皮細胞(Len epithelial cells, LECs)的增殖及DNA的影響。方法:兔LECs分別與終濃度為0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1及0.3 mg·L-1的華蟾素培養(yǎng)72小時。MTT法測定不同濃度的華蟾素對培養(yǎng)的兔LECs的增殖抑制率;DNA電泳觀察華蟾素對LECs DNA結構的影響。結果:0.1 mg·L-1~0.3 mg·L-1的華蟾素能明顯抑制兔LECs增殖,增殖抑制率隨藥物濃度的升高而升高;0.1 mg·L-1~0.3 mg·L-1濃度的華蟾素在作用72小時后,DNA凝膠電泳可觀察到兔LECs出現(xiàn)典型梯狀DNA,而空白對照組則為完整DNA。結論:0.1mg·L-1~0.3mg·L-1的華蟾素能抑制LECs增殖、誘導LECs凋亡,可能成為預防后發(fā)性白內障的藥物之一。
華蟾素 晶狀體上皮細胞 抗增殖 DNA結構 凋亡
華蟾素(Cinobufotalin)為紗蟾蜍科動物中華大蟾蜍(Bufobufo gargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(B.melano stictus Schneider)等的全皮提取制劑, 具有清熱解毒,利水消腫,化瘀潰堅等作用,已列為國家級中藥保護品種并已廣泛應用于臨床[1]。本研究通過建立兔晶狀體上皮細胞(Len epithelial cells, LECs)的體外培養(yǎng)體系,探討不同濃度的華蟾素干預兔LECs生長的效應及對DNA結構的影響。
華蟾素注射液(Cinobufacini Injection)為安徽金蟾生化股份有限公司生產(chǎn)(批號060228-1);DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA ,均購自美國Gibco公司;DNA Marker、DNA Ladders凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術公司。
CO2細胞培養(yǎng)箱(371型,美國),超凈工作臺(BDHC-1300ⅡA/B,蘇州),全自動酶標讀數(shù)儀(美國BioTek ELX808),Kodak2000凝膠成像系統(tǒng)(美國柯達公司)。
1.2.1兔LECs培養(yǎng)無菌條件下,取健康新鮮新西蘭白兔眼晶狀體前囊膜,用含0.01%EDTA和0.25%胰蛋白酶的混合消化液消化后,收集細胞,放入置于37℃、5%CO2、95%空氣、100%濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng),按1:2傳代,取第3代細胞進行藥物干預。
1.2.2實驗分組將對數(shù)生長期兔LECs分設不加藥物的空白對照組和藥物干預組,藥物干預組加入華蟾素注射液,使終濃度為0.1mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3mg·L-1,加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)72小時。
1.3.1MTT比色法
將對數(shù)生長期兔LECs調整至5×104個/mL.按照上述的實驗分組每組6個復孔,藥物干預2h后MTT比色法計算細胞增殖抑制率。抑制率=(1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。
1.3.2 DNA Ladders電泳
將細胞以5×105/孔接種于6孔板。經(jīng)過如上述的實驗分組及藥物干預處理后,按試劑盒(碧云天生物技術公司)說明書操作。DNA抽提完畢將洗脫液中加入1/4體積的酚蘭染色,2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳2h后,在紫外燈下觀察并攝影。
實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計學分析,以<0.05作為差別有統(tǒng)計學意義的檢驗標準。
空白對照組和藥物干預組的吸光度值見表1,ANOVA分析顯示各組吸光度值的組間差異=215.58,<0.01,藥物對LECs的增殖抑制率與藥物濃度之間的Spearman相關分析結果=0.97,<0.05,華蟾素對晶狀體上皮細胞的增殖抑制率隨藥物濃度的增加而升高。
表1 華蟾素對LECs增殖的影響
注:與空白組比較, *<0.05;與0.1mg·L-1組比較, #P<0.05;與0.2mg·L-1組比較, ◆<0.05;與0.3mg·L-1組比較, ★<0.05。
正常兔LEC DNA僅在原點附近有一區(qū)帶,藥物干預組的兔LEC DNA均顯示細胞凋亡的典型特征:DNA梯帶譜,即接近180~200 bp整數(shù)倍的DNA條帶,且隨藥物濃度的增高凋亡條帶明顯增強,見圖1所示。
M1:Marker1; M2:Marker2; N:正常對照組; a:0.1 mg·L-1藥物濃度組; b: 0.2 mg·L-1藥物濃度組; c:0.3 mg·L-1藥物濃度組。
后發(fā)性白內障(posterior capsule opacity,PCO)嚴重影響白內障手術復明的效果。有報道其發(fā)生率在術后5年,成人30%~43% ,兒童達100%[2],其預防具有重要意義。
藥物預防是目前PCO防治的重要途徑之一。由于組織病理學已經(jīng)證實白內障術后殘留的LECs在囊膜上轉分化、增生、移行,產(chǎn)生膠原,是發(fā)生后囊膜混濁的主要原因,因此能有效抑制晶狀體上皮細胞增殖的藥物能有效預防PCO的發(fā)生[3]。本研究結果濃度0.1mg·L-1~0.3mg·L-1的華蟾素能有效抑制晶狀體上皮細胞增殖,且隨藥物濃度的升高抑制效果明顯增強。
本研究的DNA電泳結果顯示0.1mg·L-1~0.3mg·L-1的華蟾素作用晶狀體上皮細胞72小時后出現(xiàn)特征性 DNA-1adder,提示華蟾素通過誘導晶狀體上皮細胞凋亡的方式來抑制其增殖,MTT及DNA電泳結果提示0.1 mg·L-1~0.3 mg·L-1的華蟾素能有效抑制LECs增殖、誘導LECs凋亡,可能成為預防后發(fā)性白內障的藥物之一。
[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部) [M].北京:化學工業(yè)出版社,2000:附錄26.
[2] Sundelin K,Sjostrand J.Posterior capsule opacification 5 years after extracapsular cataract extraction[J].J Cataract Refract Surg,1999,25(2):246-250.
[3] 徐國興,胡建章,鄭衛(wèi)東,等.基質金屬蛋白酶2和金屬蛋白酶2組織抑制因子及轉化生長因子β1在糖尿病性白內障患者晶狀體上皮細胞的表達及意義[J].中華眼科雜志,2003,39(7):411-414.
1.福建省中醫(yī)藥科研重點課題(基金編號:wzzb0606);2.福建醫(yī)科大學教授發(fā)展基金課題(基金編號:2006-js6033 );3.福建省中醫(yī)藥科研重點課題(基金編號:wzzyb0905)。
徐國興,zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。