王婷婷 徐國興何青黃 焱

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華蟾素對晶狀體上皮細(xì)胞增殖及DNA結(jié)構(gòu)的影響

王婷婷1，2徐國興1，2何青1，2黃 焱3

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科中心 2.福建省眼科研究所 3.福建醫(yī)科大學(xué)技術(shù)工程學(xué)院眼科學(xué)與視光學(xué)系

目的：探討華蟾素對兔晶狀體上皮細(xì)胞(Len epithelial cells, LECs)的增殖及DNA的影響。方法：兔LECs分別與終濃度為0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1及0.3 mg·L-1的華蟾素培養(yǎng)72小時(shí)。MTT法測定不同濃度的華蟾素對培養(yǎng)的兔LECs的增殖抑制率；DNA電泳觀察華蟾素對LECs DNA結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果：0.1 mg·L-1～0.3 mg·L-1的華蟾素能明顯抑制兔LECs增殖，增殖抑制率隨藥物濃度的升高而升高；0.1 mg·L-1～0.3 mg·L-1濃度的華蟾素在作用72小時(shí)后，DNA凝膠電泳可觀察到兔LECs出現(xiàn)典型梯狀DNA，而空白對照組則為完整DNA。結(jié)論：0.1mg·L-1～0.3mg·L-1的華蟾素能抑制LECs增殖、誘導(dǎo)LECs凋亡，可能成為預(yù)防后發(fā)性白內(nèi)障的藥物之一。

華蟾素 晶狀體上皮細(xì)胞 抗增殖 DNA結(jié)構(gòu) 凋亡

華蟾素（Cinobufotalin）為紗蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍（Bufobufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（B.melano stictus Schneider）等的全皮提取制劑, 具有清熱解毒，利水消腫，化瘀潰堅(jiān)等作用，已列為國家級中藥保護(hù)品種并已廣泛應(yīng)用于臨床[1]。本研究通過建立兔晶狀體上皮細(xì)胞（Len epithelial cells, LECs）的體外培養(yǎng)體系，探討不同濃度的華蟾素干預(yù)兔LECs生長的效應(yīng)及對DNA結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

華蟾素注射液（Cinobufacini Injection）為安徽金蟾生化股份有限公司生產(chǎn)（批號060228-1）；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA ，均購自美國Gibco公司；DNA Marker、DNA Ladders凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)公司。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（371型，美國），超凈工作臺（BDHC-1300ⅡA/B，蘇州），全自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀（美國BioTek ELX808）,Kodak2000凝膠成像系統(tǒng)（美國柯達(dá)公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1兔LECs培養(yǎng)無菌條件下，取健康新鮮新西蘭白兔眼晶狀體前囊膜，用含0.01%EDTA和0.25%胰蛋白酶的混合消化液消化后，收集細(xì)胞，放入置于37℃、5%CO2、95%空氣、100%濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，按1:2傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組將對數(shù)生長期兔LECs分設(shè)不加藥物的空白對照組和藥物干預(yù)組，藥物干預(yù)組加入華蟾素注射液，使終濃度為0.1mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3mg·L-1,加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1MTT比色法

將對數(shù)生長期兔LECs調(diào)整至5×104個(gè)／mL．按照上述的實(shí)驗(yàn)分組每組6個(gè)復(fù)孔，藥物干預(yù)2h后MTT比色法計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值／對照組吸光度值）×100％。

1.3.2 DNA Ladders電泳

將細(xì)胞以5×105/孔接種于6孔板。經(jīng)過如上述的實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)處理后，按試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）說明書操作。DNA抽提完畢將洗脫液中加入1/4體積的酚蘭染色，2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳2h后，在紫外燈下觀察并攝影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 12．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以<0.05作為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果

空白對照組和藥物干預(yù)組的吸光度值見表1，ANOVA分析顯示各組吸光度值的組間差異=215.58,<0.01，藥物對LECs的增殖抑制率與藥物濃度之間的Spearman相關(guān)分析結(jié)果=0.97,<0.05，華蟾素對晶狀體上皮細(xì)胞的增殖抑制率隨藥物濃度的增加而升高。

表1 華蟾素對LECs增殖的影響

注：與空白組比較, *<0.05；與0.1mg·L-1組比較, ＃P<0.05；與0.2mg·L-1組比較, ◆<0.05；與0.3mg·L-1組比較, ★<0.05。

2.2 華蟾素對兔LEC DNA結(jié)構(gòu)的影響

正常兔LEC DNA僅在原點(diǎn)附近有一區(qū)帶，藥物干預(yù)組的兔LEC DNA均顯示細(xì)胞凋亡的典型特征：DNA梯帶譜，即接近180～200 bp整數(shù)倍的DNA條帶，且隨藥物濃度的增高凋亡條帶明顯增強(qiáng)，見圖1所示。

M1:Marker1; M2:Marker2; N:正常對照組; a：0.1 mg·L-1藥物濃度組; b: 0.2 mg·L-1藥物濃度組; c:0.3 mg·L-1藥物濃度組。

3 討論

后發(fā)性白內(nèi)障（posterior capsule opacity,PCO）嚴(yán)重影響白內(nèi)障手術(shù)復(fù)明的效果。有報(bào)道其發(fā)生率在術(shù)后5年，成人30%～43% ，兒童達(dá)100%[2]，其預(yù)防具有重要意義。

藥物預(yù)防是目前PCO防治的重要途徑之一。由于組織病理學(xué)已經(jīng)證實(shí)白內(nèi)障術(shù)后殘留的LECs在囊膜上轉(zhuǎn)分化、增生、移行，產(chǎn)生膠原，是發(fā)生后囊膜混濁的主要原因，因此能有效抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖的藥物能有效預(yù)防PCO的發(fā)生[3]。本研究結(jié)果濃度0.1mg·L-1~0.3mg·L-1的華蟾素能有效抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖，且隨藥物濃度的升高抑制效果明顯增強(qiáng)。

本研究的DNA電泳結(jié)果顯示0.1mg·L-1~0.3mg·L-1的華蟾素作用晶狀體上皮細(xì)胞72小時(shí)后出現(xiàn)特征性 DNA-1adder,提示華蟾素通過誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的方式來抑制其增殖，MTT及DNA電泳結(jié)果提示0.1 mg·L-1～0.3 mg·L-1的華蟾素能有效抑制LECs增殖、誘導(dǎo)LECs凋亡，可能成為預(yù)防后發(fā)性白內(nèi)障的藥物之一。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部) [M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000：附錄26.

[2] Sundelin K,Sjostrand J.Posterior capsule opacification 5 years after extracapsular cataract extraction[J].J Cataract Refract Surg,1999,25(2):246-250.

[3] 徐國興,胡建章,鄭衛(wèi)東,等.基質(zhì)金屬蛋白酶2和金屬蛋白酶2組織抑制因子及轉(zhuǎn)化生長因子β1在糖尿病性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)及意義[J].中華眼科雜志,2003,39(7):411-414.

1.福建省中醫(yī)藥科研重點(diǎn)課題(基金編號：wzzb0606);2.福建醫(yī)科大學(xué)教授發(fā)展基金課題(基金編號：2006-js6033 )；3.福建省中醫(yī)藥科研重點(diǎn)課題(基金編號：wzzyb0905)。

徐國興,zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。