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        華蟾素對晶狀體上皮細(xì)胞增殖及DNA結(jié)構(gòu)的影響

        2010-01-07 01:09:04王婷婷徐國興何青黃
        海峽科學(xué) 2010年5期
        關(guān)鍵詞:華蟾素徐國電泳

        王婷婷 徐國興何青黃 焱

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        華蟾素對晶狀體上皮細(xì)胞增殖及DNA結(jié)構(gòu)的影響

        王婷婷1,2徐國興1,2何青1,2黃 焱3

        1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科中心 2.福建省眼科研究所 3.福建醫(yī)科大學(xué)技術(shù)工程學(xué)院眼科學(xué)與視光學(xué)系

        目的:探討華蟾素對兔晶狀體上皮細(xì)胞(Len epithelial cells, LECs)的增殖及DNA的影響。方法:兔LECs分別與終濃度為0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1及0.3 mg·L-1的華蟾素培養(yǎng)72小時(shí)。MTT法測定不同濃度的華蟾素對培養(yǎng)的兔LECs的增殖抑制率;DNA電泳觀察華蟾素對LECs DNA結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果:0.1 mg·L-1~0.3 mg·L-1的華蟾素能明顯抑制兔LECs增殖,增殖抑制率隨藥物濃度的升高而升高;0.1 mg·L-1~0.3 mg·L-1濃度的華蟾素在作用72小時(shí)后,DNA凝膠電泳可觀察到兔LECs出現(xiàn)典型梯狀DNA,而空白對照組則為完整DNA。結(jié)論:0.1mg·L-1~0.3mg·L-1的華蟾素能抑制LECs增殖、誘導(dǎo)LECs凋亡,可能成為預(yù)防后發(fā)性白內(nèi)障的藥物之一。

        華蟾素 晶狀體上皮細(xì)胞 抗增殖 DNA結(jié)構(gòu) 凋亡

        華蟾素(Cinobufotalin)為紗蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍(Bufobufo gargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(B.melano stictus Schneider)等的全皮提取制劑, 具有清熱解毒,利水消腫,化瘀潰堅(jiān)等作用,已列為國家級中藥保護(hù)品種并已廣泛應(yīng)用于臨床[1]。本研究通過建立兔晶狀體上皮細(xì)胞(Len epithelial cells, LECs)的體外培養(yǎng)體系,探討不同濃度的華蟾素干預(yù)兔LECs生長的效應(yīng)及對DNA結(jié)構(gòu)的影響。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        華蟾素注射液(Cinobufacini Injection)為安徽金蟾生化股份有限公司生產(chǎn)(批號060228-1);DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA ,均購自美國Gibco公司;DNA Marker、DNA Ladders凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)公司。

        CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(371型,美國),超凈工作臺(BDHC-1300ⅡA/B,蘇州),全自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀(美國BioTek ELX808),Kodak2000凝膠成像系統(tǒng)(美國柯達(dá)公司)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1兔LECs培養(yǎng)無菌條件下,取健康新鮮新西蘭白兔眼晶狀體前囊膜,用含0.01%EDTA和0.25%胰蛋白酶的混合消化液消化后,收集細(xì)胞,放入置于37℃、5%CO2、95%空氣、100%濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng),按1:2傳代,取第3代細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)。

        1.2.2實(shí)驗(yàn)分組將對數(shù)生長期兔LECs分設(shè)不加藥物的空白對照組和藥物干預(yù)組,藥物干預(yù)組加入華蟾素注射液,使終濃度為0.1mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3mg·L-1,加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。

        1.3 觀察指標(biāo)及方法

        1.3.1MTT比色法

        將對數(shù)生長期兔LECs調(diào)整至5×104個(gè)/mL.按照上述的實(shí)驗(yàn)分組每組6個(gè)復(fù)孔,藥物干預(yù)2h后MTT比色法計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

        1.3.2 DNA Ladders電泳

        將細(xì)胞以5×105/孔接種于6孔板。經(jīng)過如上述的實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)處理后,按試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)說明書操作。DNA抽提完畢將洗脫液中加入1/4體積的酚蘭染色,2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳2h后,在紫外燈下觀察并攝影。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以<0.05作為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

        2 結(jié)果

        2.1 MTT結(jié)果

        空白對照組和藥物干預(yù)組的吸光度值見表1,ANOVA分析顯示各組吸光度值的組間差異=215.58,<0.01,藥物對LECs的增殖抑制率與藥物濃度之間的Spearman相關(guān)分析結(jié)果=0.97,<0.05,華蟾素對晶狀體上皮細(xì)胞的增殖抑制率隨藥物濃度的增加而升高。

        表1 華蟾素對LECs增殖的影響

        注:與空白組比較, *<0.05;與0.1mg·L-1組比較, #P<0.05;與0.2mg·L-1組比較, ◆<0.05;與0.3mg·L-1組比較, ★<0.05。

        2.2 華蟾素對兔LEC DNA結(jié)構(gòu)的影響

        正常兔LEC DNA僅在原點(diǎn)附近有一區(qū)帶,藥物干預(yù)組的兔LEC DNA均顯示細(xì)胞凋亡的典型特征:DNA梯帶譜,即接近180~200 bp整數(shù)倍的DNA條帶,且隨藥物濃度的增高凋亡條帶明顯增強(qiáng),見圖1所示。

        M1:Marker1; M2:Marker2; N:正常對照組; a:0.1 mg·L-1藥物濃度組; b: 0.2 mg·L-1藥物濃度組; c:0.3 mg·L-1藥物濃度組。

        3 討論

        后發(fā)性白內(nèi)障(posterior capsule opacity,PCO)嚴(yán)重影響白內(nèi)障手術(shù)復(fù)明的效果。有報(bào)道其發(fā)生率在術(shù)后5年,成人30%~43% ,兒童達(dá)100%[2],其預(yù)防具有重要意義。

        藥物預(yù)防是目前PCO防治的重要途徑之一。由于組織病理學(xué)已經(jīng)證實(shí)白內(nèi)障術(shù)后殘留的LECs在囊膜上轉(zhuǎn)分化、增生、移行,產(chǎn)生膠原,是發(fā)生后囊膜混濁的主要原因,因此能有效抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖的藥物能有效預(yù)防PCO的發(fā)生[3]。本研究結(jié)果濃度0.1mg·L-1~0.3mg·L-1的華蟾素能有效抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖,且隨藥物濃度的升高抑制效果明顯增強(qiáng)。

        本研究的DNA電泳結(jié)果顯示0.1mg·L-1~0.3mg·L-1的華蟾素作用晶狀體上皮細(xì)胞72小時(shí)后出現(xiàn)特征性 DNA-1adder,提示華蟾素通過誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的方式來抑制其增殖,MTT及DNA電泳結(jié)果提示0.1 mg·L-1~0.3 mg·L-1的華蟾素能有效抑制LECs增殖、誘導(dǎo)LECs凋亡,可能成為預(yù)防后發(fā)性白內(nèi)障的藥物之一。

        [1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部) [M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:附錄26.

        [2] Sundelin K,Sjostrand J.Posterior capsule opacification 5 years after extracapsular cataract extraction[J].J Cataract Refract Surg,1999,25(2):246-250.

        [3] 徐國興,胡建章,鄭衛(wèi)東,等.基質(zhì)金屬蛋白酶2和金屬蛋白酶2組織抑制因子及轉(zhuǎn)化生長因子β1在糖尿病性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)及意義[J].中華眼科雜志,2003,39(7):411-414.

        1.福建省中醫(yī)藥科研重點(diǎn)課題(基金編號:wzzb0606);2.福建醫(yī)科大學(xué)教授發(fā)展基金課題(基金編號:2006-js6033 );3.福建省中醫(yī)藥科研重點(diǎn)課題(基金編號:wzzyb0905)。

        徐國興,zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。

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