廖柏寒,劉 俊,周 航,曾 敏,黃運湘 ,周細紅,曾清如 (.中南林業(yè)科技大學生物技術開放性中心實驗室,湖南 長沙 40004；.南華大學藥學與生命科學院,湖南 衡陽 400；.湖南農業(yè)大學資源環(huán)境學院,湖南 長沙 408)

重金屬在土壤中的累積與污染問題越來越受到人們的關注[1-2].隨著城市的發(fā)展、礦山的開采、農資的使用,土壤環(huán)境和食物鏈中鎘(Cd)的總量正日益增加[3-4].Cd對植物具有重金屬毒害

性,影響植物的生理生化過程[5-6].研究表明,Cd脅迫能影響大豆幼苗POD活性、根系的生長,并導致膜脂過氧化傷害[7].Cd脅迫導致花莢期大豆生長受到抑制、植株生物量降低、保護性酶功能失調[8].植物在受到重金屬脅迫的生長過程中,其生長及生理應隨植物生長發(fā)育階段的不同而呈現特異性變化.本研究通過土壤盆栽試驗,研究不同濃度Cd持續(xù)脅迫對大豆不同發(fā)育階段(幼苗期、花莢期、成熟期)生長及生理指標的影響,旨在探討植物遭受 Cd脅迫的生理生態(tài)效應,以期為我國土壤-植物系統的Cd污染的治理以及農作物的安全生產提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 供試材料

CdCl2·2.5H2O,分析純,購于長沙市國營延風化學試劑廠;尿素與氯化鉀,分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司;磷酸二氫鉀,分析純,購于廣東省臺山市化工廠.

供試大豆(Glycine max)品種為“五月王”,由黑龍江省尚志市銀河種苗有限公司提供.供試土壤采自湖南農業(yè)大學教學實驗場,類型為第四紀紅土發(fā)育的紅壤.土壤基本性質為:pH 4.57、CEC 10.3cmol/kg、有機質15.6g/kg、全氮1.41g/kg、有效態(tài)鎘 0.050mg/kg.

1.2 盆栽試驗

土壤樣品采回后經自然風干、錘碎、過5mm篩,按每kg土加0.10g N,0.15g P2O5,0.10g K2O計算,以尿素、磷酸二氫鉀、氯化鉀為肥源,溶于水后與含Cd溶液一起噴灑在土壤中拌勻后裝盆(聚乙烯盆,直徑40cm,深20cm),每盆裝風干土15.0kg.外源 Cd添加量為0,0.25,0.50,1.00,2.50, 5.00,10.00mg/kg,以Cd添加量0mg/kg為對照.每處理重復3次.選取籽粒飽滿的大豆種子以0.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒30min,用去離子水沖洗干凈后于2008年4月10日播于土壤中,每盆播種30粒,待大豆植株第2片真葉全部展開時,每盆保留27株苗(發(fā)芽最少的為27株/盆).根據土壤水分蒸發(fā)情況,不定期澆灌蒸餾水,以保持土壤持水量70%.

1.3 測定方法

分別在大豆幼苗期(播種后第27d)、花莢期(播種后第48d)、成熟期(播種后第76d)取大豆植株頂端第3和4片完全展開的葉片測定生理生化指標.測定大豆整株生物量(鮮重,g/株)和植株高度(大豆植株莖的基部至頂芽的高度,cm).大豆植株SOD活性用南京建成生物工程研究所的SOD試劑盒測定,以每mL反應液 SOD抑制率達到50%時所對應的SOD量為一個 SOD活力單位(U),單位用 U/g 表示;POD活性用愈創(chuàng)木酚法測定,酶活性以每min內吸光度A470變化 0.01為一個酶活性單位,單位用 U/(min·g)表示;MDA含量用TBA(硫代巴比妥酸)法測定,單位為μmol/g;葉綠素含量用 95%酒精浸提研磨,于分光光度計比色測定,計算總葉綠素含量,單位為mg/g[9].

1.4 數據處理

實驗數據用統計學方法處理.結果用“平均值±標準差”表示;統計及回歸分析用Excel2003、DPS v6.55和SPSS 13.0進行.

2 結果與分析

2.1 Cd脅迫下大豆不同生長期生長特征

Cd脅迫下,大豆植株不同發(fā)育階段的生物量和株高的生長狀況如圖1所示.在低濃度Cd(≤0.50mg/kg)條件下,Cd脅迫對大豆植株不同生長期的生物量和植株高度均具有一定的“刺激效應”(即與對照相比,相應的生長生理指標有所增加),且刺激效應呈現幼苗期＜花莢期＜成熟期的規(guī)律.顯然,大豆對低濃度 Cd具有一定的耐受性.但隨著Cd濃度的增加,大豆植株生物量和高度受到明顯抑制,Cd濃度越高其抑制效應(即與對照相比,相應的生長生理指標有所下降)越明顯,并且有著成熟期＞花莢期＞幼苗期的規(guī)律.即,隨著大豆的生長發(fā)育,高濃度Cd(≥1.00mg/kg)脅迫對大豆植株生物量和株高增長的抑制效應逐漸增強.對外源Cd濃度與大豆植株生物量、株高進行回歸分析發(fā)現(圖1),雖然在Cd低濃度區(qū)間內大豆植株生物量和株高出現先增加后降低的變化,但是在整個Cd脅迫濃度區(qū)間內大豆植株生物量和株高呈現隨著Cd濃度增加而顯著線性下降的趨勢,表明大豆不同生長期植株高度和生物量的變化對土壤Cd污染水平具有一定的指示作用.大豆株高與Cd濃度回歸方程的斜率絕對值大于大豆生物量與Cd濃度回歸方程的斜率絕對值,表明大豆株高變化對 Cd脅迫的敏感性明顯高于生物量的敏感性.

圖1 Cd脅迫下大豆不同發(fā)育階段植株生物量與高度Fig.1 Biomass and height of soybean plants at different growth stages under Cd stress

2.2 Cd脅迫下大豆不同生長期SOD活性特征

超氧化物歧化酶(SOD)是生物機體防御過氧化損傷系統的關鍵酶之一,是一類敏感的分子生態(tài)毒理學指標[10].從圖2可知,在 Cd濃度≤0.50mg/kg時,大豆植株各生長期的SOD活性雖有所增加,但增加幅度不大;當Cd濃度＞0.50mg/kg時,大豆不同生長期SOD活性隨Cd濃度的增加變化呈現不同的變化趨勢.在幼苗期,大豆SOD活性隨Cd濃度的增加呈現顯著的指數型關系平緩下降.當大豆生長至花莢期,SOD活性隨Cd濃度的增加呈明顯的S型邏輯斯蒂增長.在成熟期,大豆SOD活性又隨Cd濃度的增加呈顯著的指數函數下降.

圖2 Cd脅迫下大豆不同發(fā)育階段SOD活性特征Fig.2 SOD activities of soybean plants at different growth stages under Cd stress

2.3 Cd脅迫下大豆不同生長期POD活性特征

過氧化物酶(POD)是植物體內重要的保護酶,在逆境脅迫中被激活的程度最大,持續(xù)時間長,在有效地清除代謝過程中產生的活性氧的過程中起著關鍵作用[11].由圖3可見,外源Cd濃度一定時,大豆POD的活性呈現幼苗期＜花莢期＜成熟期的規(guī)律.在幼苗期,大豆POD活性隨外源Cd濃度的增加而呈現典型的S型邏輯斯諦增長趨勢;在花莢期,大豆POD活性雖然在低濃度外源Cd脅迫時低于對照值,但整體上隨外源Cd濃度的增加呈顯著的線性增長趨勢;在成熟期,大豆POD活性隨外源Cd濃度的增加而先增加后降低,二者表現為較明顯的雙曲線函數關系.從回歸方程可知(圖3),幼苗期和成熟期大豆POD活性隨著外源Cd濃度的增加存在一個極值,且成熟期的極值大于幼苗期的極值.這表明幼苗期和成熟期大豆通過POD活性的增加來減緩Cd脅迫的毒性是有限的,且大豆成熟期對Cd的耐受力大于幼苗期的耐受力.大豆花莢期正處于生長發(fā)育的旺期,可以通過POD活性的急劇增加(Cd濃度每增加一個單位,POD活性增加約29倍)來緩解Cd的植物毒性.

圖3 Cd 脅迫下大豆不同發(fā)育階段POD活性特征Fig.3 POD activities of soybean plants at different growth stages under Cd stress

2.4 Cd脅迫下大豆不同生長期葉綠素含量特征

圖4 Cd 脅迫下大豆不同發(fā)育階段葉綠素含量變化特征Fig.4 Chlorophyll contents of soybean plants at different growth stages under Cd stress

葉綠素是光合作用的重要物質,其含量的高低在很大程度上反映了植物的生長狀況和葉片的光合能力[12].從圖4可以看出,在大豆不同生長期Cd脅迫對葉綠素含量的影響明顯不同.在幼苗期,大豆植株脆弱,生長緩慢,容易受到Cd脅迫傷害,葉綠素含量隨著Cd脅迫濃度的增加而成直線型降低.在花莢期,大豆葉綠素含量隨Cd脅迫濃度的增加而呈現線性緩慢升高趨勢,并且整體上高于幼苗期和成熟期葉綠素含量.其原因很可能是,花莢期大豆正處于生長旺盛期,植株整體生理功能增強,葉綠素含量隨著大豆植株的強勁生長而增加,掩飾了Cd脅迫對葉綠素的影響.在大豆成熟期,葉綠素含量隨Cd處理濃度的增加先增加后降低,二者呈顯著的二項式函數關系,這是因為成熟期大豆植株生長緩慢,又受 Cd脅迫時間過長,最終由于Cd的毒害導致葉綠素含量下降.

2.5 Cd脅迫下大豆不同生長期MDA含量特征

圖5 Cd 脅迫下大豆不同發(fā)育階段MDA含量變化特征Fig.5 MDA contents of soybean plants at different growth stages under Cd stress

丙二醛(MDA)是植物膜脂過氧化的主要產物,其含量直接反映膜脂過氧化程度[13].圖5表明,在外源Cd脅迫下,大豆植株MDA含量隨Cd濃度的增加在幼苗期和花莢期呈現先增加后降低趨勢,在成熟期呈現緩慢下降趨勢.當外源Cd濃度一定時,大豆MDA的含量在整體上呈現幼苗期＜成熟期＜花莢期的規(guī)律,表明Cd脅迫對大豆植株不同生長期造成的膜脂過氧化強度為:幼苗期＜成熟期＜花莢期.對于大豆植株的幼苗期、花莢期、成熟期,MDA含量最大值對應的外源Cd脅迫濃度分別為5.00,2.50,1.00mg/kg,這表明引起植株的膜脂過氧化傷害最嚴重的Cd濃度隨著大豆的生長發(fā)育而顯著降低,大豆植株耐受Cd毒性的能力隨著大豆的生長發(fā)育而顯著降低.

3 討論

通常情況下,隨著重金屬濃度的增加,植物生理指標的變化表現為葉片葉綠素含量逐漸降低,葉片和根系中SOD、POD活性先升高后降低,而MDA含量則逐漸升高,與重金屬添加濃度具有很好的正的相關性,植物葉片和根系中MAD含量的變化可以在一定程度上反映土壤重金屬的污染水平[14-18].

植物在重金屬污染環(huán)境中生長,隨著重金屬濃度的增加可能出現中毒直至死亡,植物的葉綠素含量、SOD和POD活性、MDA含量等生理指標的協調性變化應該反映這個過程.本研究發(fā)現,Cd脅迫對大豆植株的生理生態(tài)效應隨著大豆生長發(fā)育的不同呈現不同的特點.在幼苗期,在Cd脅迫下,大豆植株生物量和株高生長性狀上表現出低濃度(≤0.50mg/kg)的刺激效應和高濃度(≥1.00mg/kg)的抑制效應;隨著Cd脅迫濃度的增加,大豆POD活性迅速增加并維持在較高水平,葉綠素含量和SOD活性呈下降趨勢,植株MDA含量先增加后降低.在花莢期,大豆植株的生長性狀(株高和生物量)對Cd脅迫也表現為低濃度的刺激效應和高濃度的抑制效應,且這2種效應的強度均明顯高于幼苗期大豆.隨著Cd脅迫濃度的增加,大豆植株部分葉片出現黃化現象,SOD、POD活性及葉綠素含量呈上升趨勢,MDA含量呈拋物線狀先上升后下降.在成熟期,部分大豆植株葉片出現黃化現象,高濃度Cd脅迫下,大豆植株葉片嚴重皺縮,且整個植株的脆性增大容易折斷,株高增長極為緩慢.在這期間,大豆植株的葉綠素含量、SOD活性、POD活性、MDA含量隨著Cd脅迫濃度的增加均呈現先上升后下降趨勢.這表明,在長時間、高濃度的Cd脅迫下,大豆植株的生理機能顯著降低,自身保護性酶防御系統受損,最終在植株的生物量和株高等表觀性狀上表現出來.上述試驗現象和分析表明,在中低濃度的Cd脅迫下,大豆植株通過SOD和POD活性的調節(jié)以共同防御Cd脅迫對大豆的毒性,大豆植株基本上能夠正常發(fā)育直至成熟;但隨Cd脅迫濃度的增加,大豆植株體內保護性酶對自由基的產生和消除的平衡作用失調,MDA含量增加,導致大豆細胞膜脂過氧化傷害,Cd毒性對大豆植株生物量和高度等表觀性狀的抑制效應越來越強烈,最終出現大豆葉片嚴重皺縮、脆性增大、生長幾乎停滯并瀕臨死亡.

表1 Cd脅迫下大豆生長指標與生理指標的相關性Table 1 Correlations between growth indexes and physiological indexes of soybean plants at different growth stages under Cd stress

對Cd脅迫下大豆的生長指標(株高、生物量)與生理指標進行相關性分析發(fā)現(表1),幼苗期生長指標與植株的葉綠素含量、POD活性表現為顯著相關,與SOD活性表現為極顯著相關,這表明在 Cd脅迫初期大豆的生長指標與生理指標之間存在著相當好的協調性,生理指標能夠較好的反映大豆的生長狀況.但是在花莢期和成熟期,大豆的株高和生物量與植株的葉綠素含量和POD活性之間不存在相關性,僅僅與

SOD活性存在顯著的相關性.這表明,Cd脅迫對大豆植株的生理生態(tài)效應是一個綜合效應,而且與大豆的生長期和Cd脅迫時間有關.在本研究中,監(jiān)測了大豆的葉綠素含量、POD活性、SOD活性和MDA含量等4個生理指標,其中MDA含量與大豆生長指標之間無論在哪個生長期都沒有相關性,而SOD活性在大豆的整個生長期都與生長指標顯著或極顯著相關,但是在幼苗期和成熟期是正相關,而在花莢期是負相關.Cd脅迫下大豆生長指標與生理指標之間的關系還需要進一步探討.

4 結論

4.1 Cd脅迫對大豆植株的生長在幼苗期、花莢期、成熟期均表現為低濃度下的刺激效應和高濃度下的抑制效應;但是隨著Cd脅迫濃度的增加,大豆的生長整體上受到抑制.

4.2 Cd脅迫對大豆植株的生理生態(tài)效應隨著大豆的生長發(fā)育呈現各自不同的特征.在幼苗期,大豆植株的葉綠素含量下降,SOD活性受到抑制,POD活性則迅速激活,共同緩解Cd毒性;在花莢期,大豆植株的防御系統得到有效激發(fā),保護性酶POD、SOD的活性急劇升高,葉綠素含量呈上升趨勢;在成熟期,由于長時間的Cd毒害,尤其是Cd濃度較高的情況下,大豆植株的SOD、POD活性和葉綠素含量急劇下降.

4.3 大豆植株幼苗期、花莢期、成熟期的生理指標(葉綠素含量、POD活性、SOD活性和MDA 含量)隨著Cd脅迫濃度的增加有著完全不同的變化模式.

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