陳 磊,王維山,王永明,史晨輝

膝關(guān)節(jié)鏡下所見血管翳患者滑膜中VEGF、TGF-β1的表達(dá)及其意義

陳 磊,王維山,王永明,史晨輝

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,石河子832008)

為探討VEGF、TGF-β1兩因子與血管翳的相互關(guān)系,為血管翳的臨床治療提供指導(dǎo),選擇行膝關(guān)節(jié)鏡手術(shù)且發(fā)現(xiàn)在1～3個(gè)部位出現(xiàn)血管翳的患者,根據(jù)血管翳出現(xiàn)部位的數(shù)量將其滑膜標(biāo)本篩選分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組,每組15例,其中未發(fā)現(xiàn)血管翳患者滑膜的標(biāo)本為對照組。采用免疫組化技術(shù)檢測與觀察VEGF、TGF-β1在各組中的表達(dá),分析其表達(dá)意義。結(jié)果表明:與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組中的 VEGF、TGF-β1呈高表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且與血管翳出現(xiàn)的部位數(shù)相關(guān),隨著出現(xiàn)部位的增加,VEGF、TGF-β1的陽性表達(dá)率也隨之增高;將V EGF與 TGF-β1的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Spearman相關(guān)分析,結(jié)果顯示兩因子的陽性率呈正相關(guān)(r=0.910,P=0.000)。這表明,VEGF、TGF-β1的過度表達(dá)與膝關(guān)節(jié)血管翳的形成密切相關(guān),檢測膝關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF和 TGF-β1的表達(dá)有助于預(yù)測血管翳的發(fā)展趨勢。

血管翳;滑膜;VEGF;TGF-β1

膝關(guān)節(jié)鏡下所見的血管翳是一種以血管增生,炎性細(xì)胞浸潤為特征的血管結(jié)締組織,表現(xiàn)為異常增生的毛細(xì)血管網(wǎng),與膝關(guān)節(jié)軟骨的破壞密切相關(guān),可見于多種膝關(guān)節(jié)疾病。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[1],血管翳由血管、單核細(xì)胞、纖維母細(xì)胞侵入組織內(nèi),它們可激活基質(zhì)金屬蛋白酶、組織蛋白酶和肥大細(xì)胞蛋白酶等,使軟骨基質(zhì)降解、變性,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞。新生血管生成是產(chǎn)生和維持血管翳的重要標(biāo)志,而血管生成受一系列生長因子和抑制因子的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié),其中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)在血管生成過程中的研究備受關(guān)注,但二者與血管翳的相互關(guān)系尚未明確。本研究通過免疫組化技術(shù),研究 VEGF、TGF-β1在膝關(guān)節(jié)鏡下所見血管翳患者滑膜中的表達(dá)情況及其意義,擬初步探討兩因子與血管翳的相互關(guān)系,為臨床治療提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇1998年至2008年間在新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨一科行膝關(guān)節(jié)鏡手術(shù)并發(fā)現(xiàn)其中1～3個(gè)部位(包括滑膜、叉韌帶、半月板、關(guān)節(jié)軟骨面等)出現(xiàn)血管翳(圖1)的患者,根據(jù)血管翳出現(xiàn)部位的數(shù)量將其滑膜標(biāo)本篩選分為3組,每組15例,共 45例,其中男 20例,女 25例,年齡 12～84歲,平均51.7歲;臨床診斷為膝關(guān)節(jié)滑膜炎、滑膜皺襞綜合癥27例,骨性關(guān)節(jié)炎、滑膜炎15例,類風(fēng)濕

圖1 關(guān)節(jié)鏡下發(fā)現(xiàn)血管翳Fig.1 The pannus wasfound by arthroscope

2 結(jié)果

2.2 VEGF在各組的表達(dá)情況

VEGF的陽性效應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒,主要分布于細(xì)胞漿(圖 3、圖 4)。將各實(shí)驗(yàn)組與對照組關(guān)節(jié)炎1例,化膿性關(guān)節(jié)炎1例,痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎1例。對照組為關(guān)節(jié)鏡手術(shù)中未發(fā)現(xiàn)血管翳(圖2)患者的滑膜標(biāo)本15例,男 7例,女 8例,年齡 16～82歲,平均46.3歲;臨床診斷為膝關(guān)節(jié)滑膜炎14例,痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎1例。

1.2 試劑與方法

采用免疫組化SP法,其中兔抗人V EGF和兔抗人 TGF-β1多克隆抗體(濃縮型)均購自北京博奧森生物技術(shù)公司。免疫組化染色程序按試劑盒說明書進(jìn)行操作。VEGF一抗按1∶600稀釋,TGF-β1一抗按1∶200稀釋,對照組以 PBS液代替一抗。

1.3 結(jié)果判定

VEGF、TGF-β1陽性效應(yīng)產(chǎn)物均為棕黃色顆粒,主要分布于細(xì)胞漿。參照Szekanecz等[2]方法,根據(jù)400倍視野下觀察結(jié)果評分:(1)陽性細(xì)胞百分率:陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<10%,記為0分;10%～40%記為1分;40%～70%記為2分;陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)>70%,記為3分。(2)著色強(qiáng)度:不顯色或顯色不清為0分;淺黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。將二者評分相加,作為該切片最終評分,0分為陰性,1～2分為弱陽性,3～4分為陽性,5～6分為強(qiáng)陽性。本研究中將陽性及強(qiáng)陽性結(jié)果合并統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖2 關(guān)節(jié)鏡下未發(fā)現(xiàn)血管翳Fig.2 The pannus was not found by arthroscope

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用Fisher's確切概率法分析組間差異,用Spearman法分析VEGF與 TGF-β1的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。VEGF的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行比較(表1),經(jīng) Fisher's法檢驗(yàn),P=0.000,四組間V EGF表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組中陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為13.3%、53.3%、73.3%、93.3%,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組陽性及其比率隨出現(xiàn)血管翳部位數(shù)的增加有遞增趨勢。

圖3 VEGF在滑膜組織中的陰性表達(dá)(×400),SP法Fig.3 The negative expression of VEGFin synovial membrane(×400),SP

表1 各實(shí)驗(yàn)組與對照組VEGF表達(dá)的檢測結(jié)果n/%Tab.1 The expression of VEGFin every experimental groups and control groups n/%

圖5 TGF-β1在滑膜組織中的陰性表達(dá)(×400),SP法Fig.5 The negative expression of TGF-β1 in synovial membrane(×400),SP

表2 各實(shí)驗(yàn)組與對照組TGF-β1表達(dá)的檢測結(jié)果 n/%Tab.2 The expression of TGF-β1 in every experimental groups and control groups n/%

圖4 VEGF在滑膜組織中的陽性表達(dá)(×400),SPFig.4 The positive expression of VEGFin synovial membrane(×400),SP

2.2 TGF-β1在各組的表達(dá)情況

TGF-β1陽性效應(yīng)產(chǎn)物也為棕黃色顆粒,主要分布于細(xì)胞漿(圖5、圖6)。

將各實(shí)驗(yàn)組與對照組的 TGF-β1表達(dá)結(jié)果進(jìn)行比較,經(jīng) Fisher's法檢驗(yàn),P=0.000,四組間 TGF-β1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組中的陽性強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為6.7%、40%、73.3%、86.7%,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組陽性及強(qiáng)陽性比率隨出現(xiàn)血管翳部位數(shù)的增加有遞增趨勢(表2)。

圖6 TGF-β1在滑膜組織中的陽性表達(dá)(×400),SP法Fig.6 The positive expression of TGF-β1 in synovial membrane(×400),SP

2.3 VEGF與 TGF-β1的相關(guān)性

將 VEGF與 TGF-β1的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Spearman相關(guān)分析,r=0.910,P=0.000,這表明兩因子的陽性率存在正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

血管形成包括3個(gè)不同的階段:血管發(fā)生(vasculogenesis),血管生成(angiogenesis)和動脈生成(arteriogenesis)[3]。VEGF在上述過程均有直接的促進(jìn)作用,是目前所知唯一且具有特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子,是人體中最強(qiáng)的血管生成因子[4]。V EGF與其受體結(jié)合后最主要的生物學(xué)效應(yīng)是促使內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖,并促使內(nèi)皮細(xì)胞遷移,增強(qiáng)了毛細(xì)血管通透性、使血漿外滲,有利于新生血管以出芽的方式,促成周圍血管大量形成,新生血管的數(shù)量與VEGF的表達(dá)密切相關(guān);又可使非內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF,再通過旁分泌機(jī)制作用于其他細(xì)胞[5]。由于在血管生成中具有極其重要的作用,使VEGF及其受體與某些生理過程和新生血管形成相關(guān)性疾病關(guān)系密切。血管形成是血管翳形成的重要部分,具有類腫瘤樣生長的特點(diǎn),并受多種因素影響。VEGF作為主要的血管新生因子,與血管新生拮抗因子之間的不平衡會導(dǎo)致大量病理性新生血管的形成[6]。本研究表明,與對照組相比,出現(xiàn)血管翳組中的V EGF呈高表達(dá),且與血管翳出現(xiàn)的部位數(shù)相關(guān),隨著出現(xiàn)部位的增加,VEGF的陽性表達(dá)率也隨之增高。證實(shí)VEGF的過度表達(dá)與膝關(guān)節(jié)血管翳的形成和發(fā)展密切相關(guān)并發(fā)揮重要作用。

TGF-β1是一種具有雙相調(diào)節(jié)功能的生長因子,是細(xì)胞增生、分化,細(xì)胞外基質(zhì)和免疫應(yīng)答的有效調(diào)節(jié)者[7]。它可促進(jìn)滑膜增生,增強(qiáng)炎癥細(xì)胞趨化及細(xì)胞外基質(zhì)合成,促進(jìn)血管新生,抑制免疫反應(yīng)等作用。有研究發(fā)現(xiàn),在關(guān)節(jié)炎滑膜中,TGF-β1存在于63%的滑膜襯里層細(xì)胞、45%的間質(zhì)巨噬細(xì)胞和48%的血管內(nèi)皮細(xì)胞中。Mussener等[8]曾動態(tài)觀察CIA大鼠滑膜組織 TGF-β1及其受體的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)病程進(jìn)展與 TGF-β1及受體表達(dá)增加呈動態(tài)過程。戴冽等[9]研究也發(fā)現(xiàn),在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的滑膜中,TGF-β1表達(dá)增加,并隨血管及肉芽組織的增生而表達(dá)增強(qiáng),在緩解期滑膜TGF-β1表達(dá)下降。本研究表明,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組中 TGF-β1呈高表達(dá),且與血管翳出現(xiàn)的部位數(shù)相關(guān),隨著出現(xiàn)部位的增加,TGF-β1的陽性表達(dá)率也隨之增高。提示TGF-β1的過度表達(dá)與膝關(guān)節(jié)血管翳的形成和發(fā)展密切相關(guān)并同樣發(fā)揮重要作用。

由于VEGF能特異性地促進(jìn)血管內(nèi)皮分裂、增殖及遷移,被公認(rèn)在血管生成中作為一個(gè)中心調(diào)節(jié)者,是最有力的血管生成因子。然而,越來越多的證據(jù)表明,一種特異性細(xì)胞因子所激發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)不是孤立的,而是依靠其他調(diào)節(jié)因素的存在。Tamura等[10]的研究表明,TGF-β1可活化血管因子。TGF-β1誘導(dǎo)滑膜血管增生是通過刺激滑膜細(xì)胞分泌V EGF來實(shí)現(xiàn)的,它是促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞分泌VEGF的最強(qiáng)誘導(dǎo)劑,其作用是血小板源性生長因子(PDGF)和白細(xì)胞介素(IL-1)作用的6倍。本研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1的表達(dá)與VEGF表達(dá)呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),隨著VEGF陽性表達(dá)的增高,TGF-β1的陽性表達(dá)也隨之增高。提示 TGF-β1活化并促進(jìn)VEGF的表達(dá),兩者在膝關(guān)節(jié)血管翳的形成發(fā)展中共同起協(xié)同作用。本研究表明,通過檢測膝關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF和 TGF-β1的表達(dá),有助于預(yù)測血管翳的發(fā)展趨勢;而通過抑制兩因子的表達(dá),可能成為以血管翳為特征滑膜炎的一種新型治療方式,從而指導(dǎo)臨床治療。

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The Expression of VEGFand TGF-β1in Synovial Membrane of the Patients of Knee Joint Pannus

CHEN Lei,WANG Weishan,WANG Yongming,SHI Chenhui
(The First Affiliated Hospital,Shihezi University School of Medicine,Shihezi 832002,China)

To elucidate VEGF and TGF-β1expression in synovial membrane of the patients of knee joint pannus by analyzing of them.15 synovial membrane specimensof the patientsof knee joint pannus in every groups that the pannus was found in 1～3 parts by arthroscope were selected as test group.15 specimens that the pannus was not found by arthroscope were selected as control group.Distribution of V EGF and TGF-β1in every group was observed by immunohistochemistry.The expression of them was statistically compared.The expression of VEGF and TGF-β1in control group was significantly lower than the test group(P<0.05).TGF-β1was significantly correlated with expression of VEGF(P<0.05).VEGF and TGF-β1were involved and played a important part in formation and progression of pannus.Detecting the expression of VEGF and TGF-β1in synovial membrane of knee joint can conduce to estimate the progression of pannus.

pannus;synovial membrane;VEGF;TGF-β1

R779.63

A

1007-7383(2010)01-0072-04

2009-01-13

陳 磊(1981-),男,主治醫(yī)師,專業(yè)方向?yàn)楣强茖W(xué)研究。

史晨輝(1961-),男,主任醫(yī)師,教授,從事骨科學(xué)研究;e-mail:sch7890@yahoo.com.cn。