王 輝,李小紅,王愛英,沈海濤,祝建波

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室,石河子832003)

通過p R1aS導(dǎo)肽提高植物中綠色熒光蛋白的激發(fā)強(qiáng)度

王 輝,李小紅,王愛英,沈海濤,祝建波

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室,石河子832003)

綠色熒光蛋白在植物細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)中對轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的再生存在不利的影響,為增強(qiáng)綠色熒光蛋白在植物細(xì)胞中的表達(dá),在 mgf p的5’端連接了p R1aS信號肽序列,同時在3’末端引入滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的特異序列 KDEL,成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBL G-p R1aS-gfp,經(jīng)轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)分析,結(jié)果表明:轉(zhuǎn)化體植株顯著增加了綠色熒光蛋白在煙草中的表達(dá),同時消除了綠色熒光蛋白對植物潛在的光毒害。這為植物轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化頻率的研究和轉(zhuǎn)基因植物安全性評價提供了一種有利的工具。

p R1aS導(dǎo)肽;綠色熒光蛋白;激發(fā)強(qiáng)度;煙草

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一類存在于水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。它由 gf p基因編碼,具有238個氨基酸殘基的多肽單體,分子量約為27kD[1]。GFP有2個吸收峰,最大吸收峰在395nm處,在475nm處還有1個吸收峰,前者由紫外光激發(fā),后者由藍(lán)光激發(fā)。發(fā)射光譜也具有2個峰值,分別為509nm、540nm,在前一峰處呈現(xiàn)綠色或黃綠色熒光[2]。GFP在植物體中形成生色團(tuán),發(fā)射綠色熒光,僅需要分子氧的存在,不需任何底物和外源輔助因子的參與。GFP熒光較為穩(wěn)定,較抗光漂白,在植物體中能夠穩(wěn)定存在。GFP作為報告基因,能夠代替GUS的作用,監(jiān)測基因在生物體內(nèi)的表達(dá)和蛋白質(zhì)的定位[3]。其不需要破環(huán)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)染色而直接成像,檢測極為方便。轉(zhuǎn)基因植物中有較高水平的 GFP表達(dá)時,在長波紫外燈的直接照射下,可對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選[4]。

由于 GFP激發(fā)熒光沒有放大作用,在很多的轉(zhuǎn)基因植物中,直接觀察仍很困難,甚至在某些植物細(xì)胞中存在不表達(dá)現(xiàn)象[5,6]。此外,GFP含量高時,轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生能力下降,表明 GFP可能對細(xì)胞仍然具有一定的毒害作用,從而影響到細(xì)胞的分化[7]。GFP可定位到細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器[6,8,9]。細(xì)胞核是較大的細(xì)胞器,能積聚大量蛋白,而且細(xì)胞核中自發(fā)熒光物質(zhì)少,又與細(xì)胞壁分開,將 GFP定位到細(xì)胞核能增強(qiáng)檢測的靈敏性[6]。而Mankin等[10]研究發(fā)現(xiàn),增加ER定位能減少光毒害。

本研究以p CMBIA1304上的m GFP5為模板,在其N端連接定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號肽,并通過PCR引物在C端引入 KDEL特異的氨基酸序列,在確保GFP編碼框完整的基礎(chǔ)上,以期解決 GFP在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存著潛在的毒性問題。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草為栽培品種nc89;大腸桿菌菌株DH5α和農(nóng)桿菌菌株GV3101為石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室保存;各種限制性內(nèi)切酶和其他工具酶等,如 T4DNA連接酶,DNA回收試劑盒、x-Gal、IPTG均購于 Promega公司;p BL G植物表達(dá)載體、PCAMBIA-1304、p M G-T-Ubinitin-p R1aS載體由本實(shí)驗室提供或構(gòu)建;p M G-T Easy和p MD-T載體購于Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 p MD-T-p R1aS載體構(gòu)建

上游 P1:5′-GGATCCACCATGGGATTTGTTCT CTTTTCAC-3;

下游 P2:5′-TCTA GA GGCACGGCAA GA GT GGGA T-3′。

根據(jù)本實(shí)驗克隆的煙草p R1aS信號肽設(shè)計引物。在上下引物的5′端分別引入BamH I和Xba I酶切位點(diǎn)。堿裂解法小量提取p MG-T-Ubinitin-p R1aS質(zhì)粒(本實(shí)驗室構(gòu)建)[11],以此為模板進(jìn)行 PCR,反應(yīng)體系:質(zhì)粒模板 0.5mL,10×PCR buffer 2mL,MgCl21mL 10mmol/L dNTPs 0.3mL,引物 p R1aS up、down引物 (20mmol/L)各0.5mL,Taq DNA聚合酶(1U/mL)0.3mL,H2O 14.9mL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,58℃退火30 s,68℃延伸30s,30個循環(huán);72℃8min。

擴(kuò)增完畢,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴(kuò)增片段用DNA凝膠回收試劑盒純化。將經(jīng)純化的擴(kuò)增片段與p MD-T載體直接連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用的是CaCl2法制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。在含有氨芐青霉素(Amp),IPTG和X-gal的LB平板上挑選白色菌落,抽提質(zhì)粒篩選出重組子。

1.2.2 pMD-T-gfp載體構(gòu)建

根據(jù)p CMBIA1304質(zhì)粒上 mgf p5基因的序列,利用 Premier5.0設(shè)計合成 PCR兩端引物。并在引物的上下游分別引入Xba I和Sac I酶切位點(diǎn)。同時在 mgf p4編碼區(qū)的3’端引入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號KDEL(見下游引物下劃線部分)。引物序列如下:

gfp up,5′-TCTA GA A TG GTA GA T CTG ACT A GT AAA GG-3′;

gfp dow n,5′-GTCGAC TTA GA G CTC GTC TTT GTA TA G TTC A TC C-3′。

堿裂解法小量提取p CMBIA1304質(zhì)粒,以此為模板進(jìn)行 PCR,反應(yīng)體系:質(zhì)粒模板 0.5mL,10×PCR buffer 2mL,MgCl21mL,10mmol/L dNTPs0.3mL,引物 gfp up、down引物 (20mmol/L)各 0.5mL,Taq DNA聚合酶(1U/mL)0.3mL,H2O 13.4mL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55℃退火40s,72℃延伸40s,30個循環(huán);72℃8min。擴(kuò)增完畢,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴(kuò)增片段用DNA凝膠回收試劑盒純化。將經(jīng)純化的擴(kuò)增片段與p MD-T載體直接連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用的是CaCl2法制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。在含有氨芐青霉素(Amp),IPTG和X-gal的LB平板上挑選白色菌落,抽提質(zhì)粒篩選出重組子。

1.2.3 pMD-T-p R1aS-gfp載體構(gòu)建

用堿裂解法小量提取p MD-T-p R1aS和p MDT-gfp質(zhì)粒,用Bam H I/Xba I和 Xba I/Sac I酶切,分別回收p R1aS和gfp目的片段。10mL連接反應(yīng)體系中加入p R1aS∶gf p=3∶1的比例量,1單位T4DNA連接酶,16℃放置10h左右。對上述連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR,分別用p R1aS上游引物和gfp下游引物進(jìn)行PCR,反應(yīng)體系:連接產(chǎn)物模板1mL,10×PCR buffer 2mL,MgCl21mL 10mmol/L dNTPs 0.3mL,引物p R1aS上游和gfp下游引物(20mmol/L)各0.5mL,Taq DNA聚合酶(1U/mL)0.3mL,H2O 13.4mL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸45s,30個循環(huán);72℃8min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,回收 PCR產(chǎn)物,并在10mL連接反應(yīng)體系中加入3∶1比例量的插入片段和p MD-T載體片段,1單位 T4DNA連接酶,16℃放置10h左右。轉(zhuǎn)大腸桿菌感受態(tài),挑白斑 PCR、酶切鑒定,將鑒定為陽性的克隆送去測序。

1.2.4 植物表達(dá)載體p BLG-p R1a S-gfp構(gòu)建

堿裂解法小量提取pBL G和p MD-T-p R1asgfp的質(zhì)粒,用Bam HⅠ/SalⅠ分別進(jìn)行雙酶切,回收p BL G的大片段和p MD-T-p R1aS-gfp約844bp的目標(biāo)片段,將回收片段按大片段∶小片段=1∶3的比例16℃連接10h。連接后轉(zhuǎn)大腸桿菌感受態(tài),經(jīng)PCR篩選和酶切鑒定,提取陽性克隆質(zhì)粒,采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101,進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.2.5 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生

接種 GV3101轉(zhuǎn)化菌單菌落于含有抗生素的2mL LB液體培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)1～2d,轉(zhuǎn)接入40mL液體培養(yǎng)基中,28℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約0.5;取葉片全展開的無菌煙草葉,用剪刀剪成小塊放入滅菌的MS液體培養(yǎng)基稀釋過的農(nóng)桿菌中,侵染10～15min,其間不斷輕搖幾次;取出材料,用無菌濾紙吸去多余菌液,于MS固體培養(yǎng)基中28℃暗培養(yǎng)2d;將材料轉(zhuǎn)入MS1分化及篩選培養(yǎng)基中,在14h光照,10h黑暗的光周期和室溫條件下培養(yǎng),使其形成愈傷組織并分化出芽,其間每隔15d在相同的培養(yǎng)基上繼代1次;將長至2～3cm的芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS2上誘導(dǎo)生根,得到完整再生植株。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植物的PCR鑒定與熒光檢測

選生根良好的轉(zhuǎn)基因煙草,取1.5mL一致大小的葉片,用改良的SDS法提取煙草的DNA,將上述提取的轉(zhuǎn)煙草總DNA進(jìn)行PCR鑒定,用p R1aSup和gfp down引物進(jìn)行 PCR,反應(yīng)體系和條件同1.2.3。再生煙草植株中 GFP熒光觀測使用OL YMPUS 1×71熒光倒置顯微鏡,分別用紫外或藍(lán)色激發(fā)光觀察煙草葉片壓片或莖切片。

2 結(jié)果

2.1 植物表達(dá)載體pBLG-p R1aS-gfp構(gòu)建

利用設(shè)計的煙草p R1aS信號肽引物,以本實(shí)驗室構(gòu)建的p MG-T-Ubinitin-p R1as為模板,通過 PCR方法獲得的p MD-T-p R1aS陽性克隆,通過BamHⅠ/XbaⅠ雙酶切驗證,切出大小約90bp條帶,與預(yù)期大小一致(圖1)。利用mgf p5基因序列設(shè)計的引物,以提取的p CMBIA1304質(zhì)粒為模板,通過 PCR方法獲得的p MD-T-gfp陽性克隆,通過Xba I/Sac I雙酶切鑒定,切出大小約754bp條帶,大小與預(yù)期的一致(圖2)。p MD-T-p R1aS和p MD-T-gfp雙酶切的回收的p R1aS和gfp目標(biāo)產(chǎn)物,體外直接連接后,利用p R1aS的上游引物和gfp的下游引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物與p MD-T連接,獲得的陽性克隆經(jīng) PCR鑒定,目標(biāo)條帶約844bp,與預(yù)期一致(圖3),堿裂解法小量提取pBL G和 p MD-T-p R1aS-gfp 的質(zhì)粒 ,用 Bam HⅠ/SalⅠ進(jìn)行雙酶切,回收pBLG的大片段和p MD-T-p R1aS-gfp約844bp的小片段,體外直接連接后,獲得pblgpr1aS-gfp的陽性克隆經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定,目的條帶約844bp。測序分析結(jié)果(圖4)表明:重組基因堿基序列與原模板拼接后序列結(jié)果完全一致。

圖1 pMD-T-p R1aS酶切結(jié)果Fig.1 Endonuclease digestion result of pMD-T-p R1aS

圖2 pMD-T-gfp酶切結(jié)果Fig.2 Endonuclease digestion result of pMD-T-gfp

圖3 pMD-T-p R1aS-gfp PCR結(jié)果Fig.3 PCR result of pMD-T-p R1aS-gfp

圖4 pBLG-p R1aS-gfp酶切結(jié)果Fig.4 Endonuclease digestion result of pMD-T-p R1aS-gfp

2.2 轉(zhuǎn)基因植物的PCR鑒定與熒光檢測

將構(gòu)建的pBL G-p R1aS-gfp載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉片,經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)成苗,獲得再生苗約200株。隨機(jī)選10株再生苗,各取葉片約0.1g,分別提取總DNA,用設(shè)計的 GFP引物進(jìn)行PCR檢測。在檢測的10株再生煙草中有7株得到了預(yù)期大小的特異性的擴(kuò)增條帶,與陽性對照p BL G-p R1aS-gfp質(zhì)粒擴(kuò)增出的條帶完全相同,而非轉(zhuǎn)基因煙草的陰性對照未擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶(圖5)。

圖5 轉(zhuǎn)pBLG-p R1aS-gfp基因煙草PCR鑒定Fig.5 PCR restult of transferring pBLG-p R1aS-gfp into tabacco

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的熒光檢測

檢測結(jié)果見圖6～12。剪取檢測陽性的轉(zhuǎn)基因煙草葉片,加少許水勻漿,取1滴在玻片上,在倒置顯微鏡下觀察藍(lán)光激發(fā)下gfp的勻漿的熒光表達(dá)情況見圖6、圖7。觀察發(fā)現(xiàn),在藍(lán)光激發(fā)下轉(zhuǎn)p BL G-p R1aS-gfp煙草綠色熒光最強(qiáng),轉(zhuǎn)pBL G-gfp煙草次之,正常煙草最弱。剪取檢測陽性的轉(zhuǎn)基因煙草葉片去除葉片的經(jīng)脈,將葉肉分別在倒置熒光光顯微鏡自然光與藍(lán)光激發(fā)觀察轉(zhuǎn)基因煙草葉片與正常煙草葉片(圖8、圖9、圖12)。在藍(lán)光激發(fā)下轉(zhuǎn)p BL G-p R1aS-gfp煙草綠色熒光最強(qiáng),轉(zhuǎn)pblg-gfp煙草次之,正常煙草最弱。剪薄檢測陽性的轉(zhuǎn)基因煙草莖,將其分別在倒置熒光光顯顯微鏡下觀察(圖10,圖11)。轉(zhuǎn)p BL G-p R1aS-gfp煙草的熒光最強(qiáng),而轉(zhuǎn)pblg-gfp煙草與正常煙草熒光強(qiáng)度差不多。

圖6 轉(zhuǎn)pBLG-p R1aS-gfp結(jié)構(gòu)煙草勻漿在藍(lán)光激發(fā)下的熒光Fig.6 Transgenic tobacco homogenate(pBLG-p R1aS-gfp)at fluorescence excitation of figure

圖7 轉(zhuǎn)pBLG-gfp結(jié)構(gòu)煙草勻漿自然光和藍(lán)光下的熒光Fig.7 Transgenic tobacco Homogenate(pBLG-gfp)under natural light and blue-ray fluorescence

圖8 轉(zhuǎn)pBLG-p R1aS-gfp結(jié)構(gòu)煙草葉片在自然光和藍(lán)光下的熒光Fig.8 Transgenic tobacco leaves(pBLG-p R1aS-gfp)under natural light and blue-ray fluorescence map

圖9 轉(zhuǎn)pBLG-gfp結(jié)構(gòu)煙草葉片在自然光和藍(lán)光下的熒光Fig.9 Transgenic tobacco leaves(pBLG-gfp)under natural light and blue-ray fluorescence

圖10 轉(zhuǎn)pBLG-p R1aS-gfp結(jié)構(gòu)煙草莖在自然光和藍(lán)光下的熒光Fig.10 Transgenic tobacco stem sections(pBLG-p R1a S-gfp)under natural light and blue-ray fluorescence

圖11 轉(zhuǎn)pBLG-gfp結(jié)構(gòu)煙草莖在自然光和藍(lán)光下的熒光Fig.11 Transgenic tobacco stem sections(pBLG-gfp)under natura light and blue-ray fluorescence

圖12 普通煙草葉片在自然光和藍(lán)光下的熒光Fig.12 Normal tobacco leaves under natural light and blue-ray fluorescence

3 討論

原始的 GFP產(chǎn)生于水母的發(fā)光細(xì)胞中,并且必須經(jīng)一系列翻譯后的成熟步驟來產(chǎn)生能發(fā)出熒光的蛋白。翻譯后 GFP成熟包括2個步驟,首先折疊脫輔基蛋白成活性構(gòu)象,而后進(jìn)行環(huán)化和氧化反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光團(tuán)。GFP的折疊是溫度敏感性的,在異源系統(tǒng)中,較高的溫度不利于 GFP的表達(dá)。經(jīng)證實(shí),GFP成熟過程的溫度敏感性可以被氨基酸的替換所抑制。一般來說,體積大的氨基酸替換成小的氨基酸有利于 GFP蛋白的折疊。而本實(shí)驗所使用的m GFP5是在m GFP4的基礎(chǔ)上進(jìn)行少數(shù)幾個堿基突變,它編碼的蛋白有V163A、I167T、S175G這些突變即有利于降低 GFP折疊時溫度的敏感性,有利于蛋白的折疊。為了更有利于在植物中表達(dá),m GFP5進(jìn)一步消除 GFP編碼序列中的隱蔽性內(nèi)含子,將推測的5’端剪接位點(diǎn)和分支位點(diǎn)的識辨序列(381～462bp的堿基)進(jìn)行了變異,并且有意識地降低了內(nèi)含子的AU含量,保證 GFP在植物上的正確表達(dá),它所編碼的蛋白與野生型 GFP蛋白幾乎相同。成熟蛋白的正確折疊保持了熒光特性和保護(hù)發(fā)光團(tuán)免受溶劑的影響。

本研究前期構(gòu)建的pBin438-GFP載體經(jīng)多次農(nóng)桿菌葉盤法轉(zhuǎn)化煙草時發(fā)現(xiàn),很難再生出正常植株,在誘導(dǎo)愈傷過程中總是會出現(xiàn)因黃化、白化現(xiàn)象,不能誘導(dǎo)出芽,即使誘導(dǎo)出芽,最終得不到正常的轉(zhuǎn)基因植株。這可能是由于 GFP在細(xì)胞質(zhì)中積累過多,對植物產(chǎn)生毒害作用引起的。因此,為了讓轉(zhuǎn) GFP植物組織能夠正常再生,本研究以p CMBIA1304上的m GFP5為模板,在其N端連接信號肽,通過引物在C端引入 KDEL特異的氨基酸序列,確保 GFP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白的轉(zhuǎn)移。新構(gòu)建的植物表達(dá)載體pBL G-p R1aS-gfp通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化,能夠獲得正常再生的煙草和熒光增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因陽性植株。

本研究通過倒置顯微鏡可觀測到轉(zhuǎn)p BL G-p R1aS-gfp的煙草激發(fā)熒光的強(qiáng)度較pBL G-gfp強(qiáng),加入導(dǎo)肽可增加其在細(xì)胞里的表達(dá)。通過定位改造gf p可以快速檢測gf p在煙草中的表達(dá)量,為分析其它載體在植物中表達(dá)分析提供依據(jù)。

這種定位改造的 GFP能夠在植物中激發(fā)出較強(qiáng)的熒光,并有效解決 GFP胞質(zhì)表達(dá)對植物再生的潛在的毒害作用,因此,用它作為報告基因來研究轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化頻率和進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價均是一種極為有利的工具。

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To Increase GFP Provocation Strength Through the Introduction of Peptide p R1aS

WANG Hui,LI Xiaohong,WANG Aiying,SHEN Haitao,ZHU Jianbo
(College of Life Science/Key Laboratory of Agricultural Biotechnology,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

In the cytoplasm it play an adverse role GF Pregeneration of transformed plant cells.To enhance expression of GFPin plant cells,we successfully constructed the plant expression vector pBLG-p R1aS-gfp,in which mGF Pintroduces a signal peptide sequence of p R1aSat the 5 end and a special sequence of KDEL at the 3’end.The result confirmed that GFPwas significantly increased in transgenic tobacco,and simultaneously eliminated the potential light toxicity to plants.It provides a convenient tool for the study on transformation frequency and safety evaluation of the trans genic plants.

peptide pR1aS;modified green fluorescent protein;provocation strength;tobacco

Q933

A

1007-7383(2010)01-0001-05

2009-03-20

國家轉(zhuǎn)基因重大專項(2009ZX08011-002),新疆兵團(tuán)博士基金項目(2006jc07)

王 輝(1982-),男,碩士生,專業(yè)方向為植物基因工程技術(shù)應(yīng)用;e-mail:xiaofei4700@163.com。

祝建波(1967-),男,副研究員,從事植物基因工程技術(shù)應(yīng)用研究;e-mail:zjbshz@126.com。